Cell expansion / Espansione cellulare
Cell expansion / Espansione cellulare
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Introduction
CAR T cell therapy has advanced into commercially available treatments that have driven an influx of companies into the immunotherapy landscape. In a standard workflow, a patient’s (autologous) or donor’s (allogeneic) genetically engineered T cells must be expanded ex vivo for clinical use. Typically, T cell expansion is the longest and one of the most critical phases in the CAR T workflow. Engineered T cells are sensitive to their microenvironment and growth conditions. These responses can lead to potential undesirable cellular changes, which pose production and quality control challenges that could ultimately delay patient treatment. One of the main objectives during the expansion phase is to maintain “younger”, less differentiated memory cell phenotypes.
Figure 1 illustrates the spectrum of T cell differentiation with the less differentiated, most therapeutically desirable central memory T cells (TCM) on the left, and the less desirable, more mature effector memory T cells (TEM) and effector T cells (TEFF) on the right. Surface markers such as CD62L, CCR7, and CD28 are not present when T cells differentiate and transition toward the TEFF cell populations and become less efficacious.
T cell viability and quality following expansion has a strong influence on treatment efficacy. Fortunately, relative factors such as media and supplement use, cell density, and the culture platform have been identified and improved upon to optimize the conditions needed for a successful and robust workflow. Sampling and analysis of CAR T cells is required during the expansion process to assess cell quality and ensure safety and potency of the product.
Allogeneic vs. autologous expansion
Early cell therapy work placed an emphasis on autologous workflows, where a diseased patient’s own T cells are isolated, activated, genetically modified, expanded, and finally infused back into the patient. Key benefits to an autologous workflow are that it allows for personalized treatment and minimizes the risk of immunorejection and transfer of other diseases or viral infections. Autologous cell therapy poses several challenges, as the patient’s cells often demonstrate slower growth profiles and display more mature T cell phenotypes, most likely due to the nature of the patient’s illness and the in vivo cell environment. According to a 2019 review article, research has demonstrated these inherent patient T cell deficiencies causally relate to the slower CAR T cell expansion, persistence, and lower cytotoxicity observed in autologous therapies. These cell deficiencies directly correlate to autologous cell expansion and quality issues, and most importantly, to loss of therapeutic efficacy and slower turnaround time for patient treatment.
Allogeneic CAR T therapy has shown strong potential to change and improve the therapeutic landscape. An allogeneic workflow, which uses starting material derived from healthy donor cells, can provide more efficacious and timelier “off-the shelf” treatment options that offer standardized therapeutic product for multiple patients. Using healthy donor cells can help overcome many of the expansion and quality issues posed by patients’ T cells. It also provides the potential for re-dosing or delivering a combination of CAR T cells directed against different therapeutic targets. Despite the benefits, allogeneic cell therapy can pose a significant risk to patients by causing life-threatening graft-versus-host disease or elimination by the host immune system. Currently, these issues are a high priority, and research is underway to develop genetic CAR modifications that could mitigate host rejection risks. Since allogeneic therapies require a greater quantity of cells for production of multiple doses, allogeneic workflows tend to be of larger scale than autologous workflows and require a longer timeline, with the expansion phase generally lasting 12–18 days. The additional culture time can negatively impact cell differentiation and function of the therapeutic product. As previously discussed, unwanted differentiation of T cells results in the loss of the younger TCM populations, which can lead to decreased patient therapeutic responses and treatment efficacy.
However, successful mitigation strategies to address this include controlled isolation and activation of TCM cells, in conjunction with considerations towards cell density and supplementation throughout the expansion process. Ultimately, with successful mitigation, a potential scalable allogeneic workflow could reduce the overall cost of T cell therapy and provide greater treatment accessibility.
Activation to expansion
In cell therapy workflows, white blood cells are collected from donors in a process called leukapheresis. Selected T cell phenotypes from the white blood cells are isolated and activated to support gene transfer and the reprogramming of T cells to express CARs. With allogeneic workflows, the sourcing of T cells from healthy donors dramatically increases the probability of isolating a more desirable, early memory T cell population, which can result in higher cellular output and overall increased treatment efficacy. Co-stimulation through CD3 and a secondary signaling receptor, such as CD28, provides the “wake-up” signal to activate naïve cells. CD3 signaling is indispensable for T cell growth, while agonistic ligation of CD28 contributes to T cell survival and plays a role in cytoskeletal remodeling, production of cytokines, differentiation, and transcription and post-translational changes during expansion.
Currently, T cell activation is primarily performed using an antibody-coated magnetic bead (Figure 2) or nanoparticle technology that imitates antigen-dependent signaling with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. These technologies replace traditional home-brew methods for generic activation that used antigen-presenting cells (APCs), mitogens, soluble or plate-bound antibodies, or chemical activators. Additionally, specific cytokines, such as interleukin-2 (IL-2) and interleukin-7 (IL-7) have been shown to support activation and maintenance of the desirable TCM phenotype with a greater expansion capability. Products such as CTS Dynabeads CD3/C28 allow for isolation and activation in a one-step process for expansion of the desired T cell phenotype (Figure 2). This covalently bonded antibody bead technology does not require feeder cells, antigens, or APCs. The beads can be removed following activation or prior to genetic modification and expansion. It is important to note, both the product and protocol selected for activating the T cells should conform to the application, process, and regulatory requirements, i.e., research use only (RUO) or clinical use application. Following activation and engineering, buffer exchange is performed to transfer the desired T cells into the expansion medium. This step can be done using counterflow centrifugation in a closed an automated manner. During expansion, release of immunostimulatory cytokines, such as IL-2 and IFN-¥ at desired levels can allow CD8+ cells to survive as memory T cells during expansion.
Media
The choice of media and supplements can significantly influence the growth of the T cell population, differentiation, viability, and the CD8:CD4 ratio during expansion. It is important to select a flexible expansion medium that is compatible with other workflow processes such as T cell isolation and activation, while being amendable to various platforms ranging from static cell culture systems to larger scale dynamic bioreactors. As variation in workflows and protocols increases, manufacturers have investigated and developed optimized media and conditions to support a flexible, seamless, and scalable workflow. The media source can be a bottleneck in T cell expansion by presenting challenges including batch-to-batch variability, which can negatively impact the consistency and quality of the product output. Utilizing a chemically defined and serum-free medium from a dependable supplier with strong quality control processes can help reduce this variability. These product attributes will also minimize downstream purification and regulatory risks, as well as lower overall production costs. The significant influence of media on T cell expansion was demonstrated in a recent study conducted using a novel culture medium that was developed specifically for expansion of human T cells in allogeneic cell therapy workflows. A major challenge in CAR T workflows is the need for a larger number of cells with the preferred younger central memory T cell phenotype that results in more functionality and effective therapeutic outcomes. Modest increases in central memory cells early in the expansion phase result in larger cell yields at harvest. In this study, healthy donor T cells were tested in an 18-day allogeneic type workflow, with the results demonstrating approximately 20% higher cell proliferation by day 10 and nearly a 100% increase by day 17 using the newly formulated medium, when compared to the control medium. A 10–20% increase in the size of the desired central memory T cell subset was also demonstrated when normalized to the control medium. In addition, this boost in cells displaying an early memory phenotype coincided with a higher level of interferon gamma (IFNγ) release when healthy donor cells are used. An average 187% increase in IFNγ production across 6 patients was demonstrated when normalized to the control medium. The increase observedwill likely act as a catalyst to enhance the overall immune response and provide more efficacious patient therapies by stimulation of macrophages, neutrophils, and natural killer cells. Not only does the medium impact the expansion phase, but the benefits are dependent on and specific to the initial cell source used during the expansion phase. In these studies, a metabolic shift in the T cells allowed for a longer workflow.
Supplements
In addition to medium, supplements also play an important role in T cell expansion. L-glutamine is an essential carbon source for metabolism and differentiation that needs to be supplemented throughout the cell therapy manufacturing process. Serum is commonly used in research and can aid in supporting basal activation of T cells as well as cell growth. While serum use may be acceptable for research, it poses regulatory and supply concerns for use in clinical applications and can demonstrate variability from batch to batch, which can impact T cell differentiation and the overall product output. The availability of serum replacement alternatives, which are defined supplements shown to support comparable T cell CD8⁺/CD4⁺ ratios while maintaining high cell expansion and viability, has addressed these issues.
Perfusion
Perfusion is a bioprocessing technique that involves continuous exchange of spent media with fresh media, while retaining cells within the culture vessel. This method refreshes nutrients while preventing the buildup of toxic metabolic waste products that could negatively impact culture performance and impact product quality. This technology allows the culture to reach much higher cell densities and fold expansion within a smaller footprint and can lead to increased productivity compared with traditional batch or fed-batch processes. Perfusion has been applied to both autologous and allogeneic T cell expansion, but it is essential for most allogeneic workflows, which require a higher quantity of cells. Achieving greater density and expansion of cells in a shorter time frame can reduce the population of exhausted cells and increase the population of younger TCM cells, which are known to support more efficacious treatments. A side-by-side T cell expansion experiment comparing fed-batch and perfusion workflows in rocking motion bioreactors was used to evaluate the impact of perfusion on cell growth, cell viability, key metabolites, and growth factors. Perfusion supported a higher density of viable T cells by reducing the accumulation of lactate and ammonia during expansion. As with other cell types, these metabolites are toxic to T cells and can induce arrest of cell growth or apoptosis, which directly impacts cell viability and expansion.
Another key to allogeneic workflows is having a sufficient IL-2 concentration to support T cell survival and proliferation. Through perfusion, a sufficient level of IL-2 was maintained during expansion. On the contrary, the non-perfused culture showed the IL-2 concentration dropping to undetectable levels by day 12, which prevented cells from reaching comparable cell viability. To fully understand the role of perfusion and IL-2, an additional experiment was setup to analyze and compare cell growth and viability with perfusion and non-perfusion setups. The amount of IL-2 injected into the test non-perfusion bioreactor was equivalent to what was delivered to the perfusion control bioreactor. Despite the daily equivalent IL-2 injections, by the end of the T cell expansion phase (day 14), the non-perfusion culture expansion was only 63% of the perfusion control. While perfusion has its advantages, the high volume of perfusion medium required can be costly, and it is imperative that manufacturers optimize their process and perfusion rates to avoid medium waste. That said, the benefits of perfusion technology are undeniable for T cell expansion; it is a readily scalable solution that can help maintain a favorable culture environment for longer, more productive workflows specifically important for allogeneic cell therapy
Maintaining cell density on expansion
Additional cell culture parameters, such as maintenance cell density, have been shown to influence T cell expansion. The results of a recent evaluation of the impacts of maintaining different T cell densities demonstrated several direct effects on the quantity and quality of the cellular products. Many classical T cell expansion protocols call for the maintenance of cells at 0.5 x 10⁶ cells/mL; however, the results of this study demonstrated that a lower cell density of 0.25 x 10⁶ cells/mL correlated with higherfold cell expansion and improved viability. Conversely, increasing the maintenance cell density to 0.75 x 10⁶ cells/mL demonstrated lower-fold expansion and slightly lower cell viability. These results suggest that maintaining a lower T cell density can positively impact the quantity and quality of the cellular output by exposing the T cells to more nutrients and help maintain a larger central memory phenotype.
Restimulation
An ongoing shift toward supporting viability of the desired T cell phenotypes has created interest in understanding the durability of the response elicited by activation and reactivation in the expansion phase. In a recent study, secondary “restimulation” during the expansion phase was evaluated using CTS Dynabeads CD3/CD28. The goal was to better understand the effects of restimulation of the T cells, how it affected the therapeutic cell output, and whether it had any impact on the T cell manufacturing process. This study revealed that a single round of activation with the beads was not only sufficient to induce robust cell proliferation and high viability over the entire 20-day workflow, but also provided evidence that restimulation can cause a temporary growth lag and plunge in viability during the following days. In addition, cells subjected to secondary activation displayed a lower CD8:CD4 ratio and a sharp downregulation of central memory cell biomarkers. In both cases, with and without restimulation, there is a clear decrease in the central memory population (CD62L⁺ CCR7⁺) and an increase in the double-negative effector population (CD62L- CCR7-) in the later stages of expansion, which is much more pronounced within the restimulated group.
These results suggest that restimulation catalyzes the transition of early memory T cells into effector T cells. Slowing this transition is important to developing and finetuning T cell manufacturing processes. Overall study results show the critical importance of choosing the optimal media, supplements, platform, and process parameters that will support robust T cell expansion, while maintaining the desired early central memory T cell phenotype which is key for efficacious T cell therapies.
Regulatory and analytical testing
Knowledge of the regulatory requirements is critical to maintaining clinical approval at each stage to avoid critical issues and delays in progressing to later clinical phases. In addition, regulatory requirements influence many of the analytical quality testing requirements of cell therapy products. During the expansion phase, robust and reliable analytical tools are required to accurately measure and monitor various cellular characteristics such as proliferation, viability, differentiation status, and other cell phenotype attributes. During and after the expansion process, testing is performed for a range of required quality attributes with regulatory body-approved or in-house validated assays. These tests evaluate quality attributes related to safety, purity, and potency of the cellular product. Safety testing for microbial and fungal sterility, and the absence of mycoplasma, as well as testing for replication competent viruses and vector copy number are usually required when viral vectors are used in the manufacturing process. Purity testing is often conducted with flow cytometry techniques to assess the proportion of positive cells for respective T cell- and CAR-associated surface markers, as well as safety testing to make sure undesirable cell types are not present. Potency testing is conducted to assess the CAR T cell content with flow cytometry or PCR methods, while cytotoxicity and cytokine secretion is assessed with various in vitro assays. There are several different ways to analytically test any given cell characteristic, therefore, variability in testing presents a known source of variation during the manufacturing process.
Vision and concluding remarks
Over the last decade, many advances have been made in the field of cell therapy and there are many more to come. As time is of the essence for patient therapy solutions, efforts to reduce production and product quality release timelines are a critical focus of research and development efforts. The T cell manufacturing process is complex and currently many opportunities for variability exist at each step. Further research is underway to identify and address manufacturing variables that can affect the critical quality attributes of the final product. Implementation of greater automation, closed system manufacturing, and real-time characterization will likely be important future developments. Achieving “off-the-shelf” allogeneic, and improving upon autologous, therapeutic solutions for patients requires substantial investment in product and process development. Current and developing work for T cell expansion involves mitigating risk and developing a robust more standardized and transferable process. Key to making the journey from initial research and development to commercial manufacture as simple and as seamless as possible is a detailed understanding of the product and process development to enable successful scale-up. Equally important will be innovation within the field to explore new approaches and expand upon the currently available technologies.
A note about CAR NK cell therapies
While CAR T therapies have demonstrated success in treatment of circulating blood-related cancers, utilizing engineered T cells for other cancers, such as solid tumors, has proven challenging. An approach under extensive development involves the use of NK cells, a cell subset of the innate immune system, which have been shown to be effective in a number of clinical trials for various cancer treatments. Allogeneic NK cells exert their cytotoxic effect in an antigen-and HLA-independent manner. Engineering of CAR NKs has facilitated specific targeting to tumor-specific antigens enabling them in a solid tumor microenvironment. This aspect combined with iPSC-derived CAR NK technologies could lead to an unlimited supply of cells as an off-the-shelf solution, bypassing long lead times for patients. Recent studies with CAR-NK-19 for lymphoid tumors (CD19) and CARNK-GPC3 for solid tumors of hepatocellular carcinoma (HCC) and ovarian cancers demonstrate the promise of this approach. The workflow to generate CAR NK cells is similar to that of CAR T cells but involves sufficient ex vivo expansion of NK cell cultures to meet dose and lot size requirements for allogeneic therapies. Typically, each dose requires approximately 5 x 10⁶ cells/kg of body weight, or nearly 500 x 10⁶ cells per person. The cell culture platforms that are used for ex vivo expansion of CAR-NK cells include T-flasks, G-Rex vessels, bioreactors, or culture bags depending on scale of final clinical product. Recommended culture conditions include use of a xeno-free medium supplemented with IL-2, IL-15, and IL-21. As is the case with CAR T cells, extensive QC requirements precede the use of CAR NK cells in a clinical setting, and often include testing the cell product for its cytotoxic killing abilities on various tumor cell lines in vivo animal tumor models.
ITALIANO
Introduzione
La terapia cellulare CAR T è avanzata in trattamenti disponibili in commercio che hanno guidato un afflusso di aziende nel panorama dell'immunoterapia. In un flusso di lavoro standard, le cellule T geneticamente modificate di un paziente (autologo) o di un donatore (allogenico) devono essere espanse ex vivo per uso clinico. In genere, l'espansione delle cellule T è la fase più lunga e una delle più critiche nel flusso di lavoro CAR T. Le cellule T ingegnerizzate sono sensibili al loro microambiente e alle condizioni di crescita. Queste risposte possono portare a potenziali cambiamenti cellulari indesiderati, che pongono problemi di produzione e controllo della qualità che potrebbero ritardare il trattamento del paziente. Uno degli obiettivi principali durante la fase di espansione è mantenere fenotipi delle cellule della memoria "più giovani" e meno differenziati.
La figura 1 illustra lo spettro della differenziazione dei linfociti T con i linfociti T di memoria centrale (TCM) meno differenziati e terapeuticamente più desiderabili a sinistra e i linfociti T di memoria effettrice (TEM) e i linfociti T effettori (TEFF) meno desiderabili e più maturi su la destra. Marcatori di superficie come CD62L, CCR7 e CD28 non sono presenti quando le cellule T si differenziano e passano alle popolazioni di cellule TEFF e diventano meno efficaci.
La vitalità e la qualità delle cellule T dopo l'espansione ha una forte influenza sull'efficacia del trattamento. Fortunatamente, sono stati identificati e migliorati fattori relativi come l'uso di supporti e integratori, la densità cellulare e la piattaforma di coltura per ottimizzare le condizioni necessarie per un flusso di lavoro solido e di successo. Il campionamento e l'analisi delle cellule CAR T sono necessari durante il processo di espansione per valutare la qualità delle cellule e garantire la sicurezza e la potenza del prodotto.
Espansione allogenica vs. autologa
I primi lavori di terapia cellulare hanno posto l'accento sui flussi di lavoro autologhi, in cui le cellule T di un paziente malato vengono isolate, attivate, geneticamente modificate, espanse e infine reinfuse nel paziente. I principali vantaggi di un flusso di lavoro autologo sono che consente un trattamento personalizzato e riduce al minimo il rischio di immunorigetto e trasferimento di altre malattie o infezioni virali. La terapia cellulare autologa pone diverse sfide, poiché le cellule del paziente spesso mostrano profili di crescita più lenti e mostrano fenotipi di cellule T più maturi, molto probabilmente a causa della natura della malattia del paziente e dell'ambiente cellulare in vivo. Secondo un articolo di revisione del 2019, la ricerca ha dimostrato che queste carenze intrinseche delle cellule T del paziente sono causalmente correlate all'espansione, alla persistenza e alla minore citotossicità delle cellule CAR T più lente osservate nelle terapie autologhe. Queste carenze cellulari sono direttamente correlate all'espansione delle cellule autologhe e ai problemi di qualità e, soprattutto, alla perdita di efficacia terapeutica e ai tempi di risposta più lenti per il trattamento del paziente.
La terapia CAR T allogenica ha mostrato un forte potenziale per cambiare e migliorare il panorama terapeutico. Un flusso di lavoro allogenico, che utilizza materiale di partenza derivato da cellule donatrici sane, può fornire opzioni di trattamento "pronte all'uso" più efficaci e tempestive che offrono prodotti terapeutici standardizzati per più pazienti. L'uso di cellule donatrici sane può aiutare a superare molti dei problemi di espansione e qualità posti dalle cellule T dei pazienti. Fornisce inoltre il potenziale per ridosare o fornire una combinazione di cellule CAR T dirette contro diversi bersagli terapeutici. Nonostante i vantaggi, la terapia cellulare allogenica può rappresentare un rischio significativo per i pazienti causando una malattia del trapianto contro l'ospite pericolosa per la vita o l'eliminazione da parte del sistema immunitario dell'ospite. Attualmente, questi problemi sono una priorità assoluta e la ricerca è in corso per sviluppare modifiche genetiche CAR che potrebbero mitigare i rischi di rigetto dell'ospite. Poiché le terapie allogeniche richiedono una maggiore quantità di cellule per la produzione di dosi multiple, i flussi di lavoro allogenici tendono ad essere su scala più ampia rispetto ai flussi di lavoro autologhi e richiedono una sequenza temporale più lunga, con la fase di espansione che generalmente dura 12-18 giorni. Il tempo di coltura aggiuntivo può influire negativamente sulla differenziazione cellulare e sulla funzione del prodotto terapeutico. Come discusso in precedenza, la differenziazione indesiderata delle cellule T provoca la perdita delle popolazioni di MTC più giovani, il che può portare a una diminuzione delle risposte terapeutiche dei pazienti e dell'efficacia del trattamento.
Tuttavia, strategie di mitigazione efficaci per affrontare questo problema includono l'isolamento controllato e l'attivazione delle cellule TCM, insieme a considerazioni sulla densità cellulare e l'integrazione durante il processo di espansione. In definitiva, con una mitigazione riuscita, un potenziale flusso di lavoro allogenico scalabile potrebbe ridurre il costo complessivo della terapia con cellule T e fornire una maggiore accessibilità al trattamento.
Attivazione all'espansione
Nei flussi di lavoro di terapia cellulare, i globuli bianchi vengono raccolti dai donatori in un processo chiamato leucaferesi. Fenotipi di cellule T selezionati dai globuli bianchi vengono isolati e attivati per supportare il trasferimento genico e la riprogrammazione delle cellule T per esprimere CAR. Con i flussi di lavoro allogenici, l'approvvigionamento di cellule T da donatori sani aumenta notevolmente la probabilità di isolare una popolazione di cellule T di memoria precoce più desiderabile, il che può comportare una maggiore produzione cellulare e una maggiore efficacia complessiva del trattamento. La co-stimolazione tramite CD3 e un recettore di segnalazione secondario, come il CD28, fornisce il segnale di "risveglio" per attivare le cellule naïve. La segnalazione di CD3 è indispensabile per la crescita delle cellule T, mentre la legatura agonistica di CD28 contribuisce alla sopravvivenza delle cellule T e svolge un ruolo nel rimodellamento del citoscheletro, nella produzione di citochine, nella differenziazione e nei cambiamenti trascrizionali e post-traduzionali durante l'espansione.
Attualmente, l'attivazione delle cellule T viene eseguita principalmente utilizzando una perla magnetica rivestita di anticorpi (Figura 2) od una tecnologia di nanoparticelle che imita la segnalazione antigene-dipendente con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. Queste tecnologie sostituiscono i metodi tradizionali fatti in casa per l'attivazione generica che utilizzavano cellule presentanti l'antigene (APC), mitogeni, anticorpi solubili o legati alla piastra o attivatori chimici. Inoltre, è stato dimostrato che citochine specifiche, come l'interleuchina-2 (IL-2) e l'interleuchina-7 (IL-7) supportano l'attivazione e il mantenimento del fenotipo TCM desiderabile con una maggiore capacità di espansione. Prodotti come CTS Dynabeads CD3/C28 consentono l'isolamento e l'attivazione in un processo in una fase per l'espansione del fenotipo delle cellule T desiderato (Figura 2). Questa tecnologia di microsfere di anticorpi a legame covalente non richiede cellule feeder, antigeni o APC. Le perline possono essere rimosse dopo l'attivazione o prima della modificazione genetica e dell'espansione. È importante notare che sia il prodotto che il protocollo selezionati per l'attivazione dei linfociti T devono essere conformi all'applicazione, al processo e ai requisiti normativi, ad esempio, solo per uso di ricerca (RUO) o applicazione per uso clinico. Dopo l'attivazione e l'ingegneria, viene eseguito lo scambio del buffer per trasferire le cellule T desiderate nel mezzo di espansione. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando la centrifugazione in controcorrente in modo chiuso e automatizzato. Durante l'espansione, il rilascio di citochine immunostimolanti, come IL-2 e IFN-¥ ai livelli desiderati, può consentire alle cellule CD8+ di sopravvivere come cellule T di memoria durante l'espansione.
Condizioni e fattori che influenzano l'espansione dei linfociti T
Piattaforme di espansione
La scelta di una piattaforma per l'espansione delle cellule T dipende dall'applicazione dell'utente finale, dal volume di lavoro, dal flusso di lavoro e dai requisiti normativi. Esso fornisce un riepilogo delle diverse opzioni di piattaforma disponibili insieme ai relativi vantaggi e svantaggi. L'espansione ex vivo può verificarsi in sistemi di coltura statici o dinamici. I processi di un sistema di coltura statica possono essere eseguiti in flaconi o sacche di coltura statica permeabili ai gas. Per mantenere un sistema chiuso, molte sacche per colture cellulari statiche includono tubi sterili sigillati e connettori per il campionamento. La temperatura ei livelli di CO₂ possono essere controllati collocando colture statiche in un incubatore controllato che è impostato tipicamente rispettivamente a 37ºC e 5%. Con questo metodo, lo scambio di gas avviene solo attraverso lo scambio di mezzi. Il dispositivo G-Rex™ può essere un'opzione alternativa per un sistema di coltura statico chiuso, progettato per consentire il trasferimento di gas attraverso una membrana permeabile sul fondo del dispositivo che può consentire volumi di lavoro medio-superficiali relativamente più grandi rispetto ai flaconi. A causa delle limitazioni di volume, nutrienti e scambio di gas, un sistema di coltura statico potrebbe non essere la piattaforma ideale per i flussi di lavoro allogenici. Quando si aumentano i flussi di lavoro delle cellule T, non è detto che il successo su piccola scala garantisca lo stesso con un sistema più grande. Per il ridimensionamento, selezionare un bioreattore appropriato e sviluppare una strategia di qualità in base alla progettazione. I sistemi di piattaforme bioreattori oscillanti chiusi e automatizzati sono applicabili e robusti per flussi di lavoro e ridimensionamento autologhi e allogenici. L'uso della tecnologia del contenitore di coltura cellulare monouso da bioprocesso insieme a sistemi di bioreattori oscillanti automatizzati, consentono il monitoraggio e il controllo dell'ossigeno disciolto (DO), del pH, del glucosio e dei metaboliti come lattato e ammonio. Il movimento e l'angolo del bioreattore oscillante consentono una miscelazione uniforme e un'agitazione delicata. Le sacche di coltura monouso presterilizzate compatibili sono dotate di più sensori, consentendo il controllo e la refertazione automatizzati. Per l'elaborazione fed-batch, questi sistemi monitorano il volume della coltura con misurazioni continue del peso. Durante l'espansione, le condizioni tipiche includono un pH compreso tra 6,6 e 7,0, un intervallo di CO₂ compreso tra 6,6 e 7,5% e un intervallo di DO compreso tra 30 e 50% per garantire la vitalità. La velocità e l'angolo di agitazione ideali dipendono dal volume di lavoro e dalle dimensioni del sacco. Per un sistema oscillante come il bioreattore oscillante Thermo Scientific™ HyPerforma™, un volume di 1,5 l in un bioreattore (sacchetto) da 10 l avrà in genere un'agitazione di 8 giri/min e un angolo di oscillazione di 6 gradi. Si prevede che un aumento dell'agitazione e dell'angolo aumenterà con l'uso di volumi di espansione delle cellule T maggiori. Recentemente, l'utilizzo di un bioreattore agitato da banco a bassa forza di taglio con un processo fed-batch o di perfusione è stato considerato una piattaforma di espansione delle cellule T. Se dimostrato di successo, ciò potrebbe avere un impatto significativo, in particolare sulle terapie allogeniche, che richiedono elevate rese di cellule T. Un sistema di bioreattore da banco agitato modulare potrebbe potenzialmente aiutare a ridurre i costi poiché questi sistemi sono altamente automatizzati e richiedono meno manipolazione. Inoltre, possono essere utilizzati in una gamma più ampia di volumi, dalla ricerca alla scala della commercializzazione. Questa capacità riduce o elimina la necessità di riprogettare e passare a un processo di scale-up completamente diverso, che può essere costoso e introdurre rischi di errori di transizione. Ciò può essere particolarmente importante quando i processi sono bloccati negli studi clinici di fase 2 o 3. Inoltre, i bioreattori da banco agitati possono raggiungere un coefficiente di trasferimento di massa volumetrico (KLa) più elevato, che supporta un'erogazione di ossigeno efficace e omogenea all'interno del bioreattore.
Media
La scelta dei mezzi e degli integratori può influenzare significativamente la crescita della popolazione di cellule T, la differenziazione, la vitalità e il rapporto CD8:CD4 durante l'espansione. È importante selezionare un mezzo di espansione flessibile che sia compatibile con altri processi del flusso di lavoro come l'isolamento e l'attivazione delle cellule T, pur essendo modificabile per varie piattaforme che vanno dai sistemi di coltura cellulare statica a bioreattori dinamici su larga scala. Con l'aumento delle variazioni nei flussi di lavoro e nei protocolli, i produttori hanno studiato e sviluppato supporti e condizioni ottimizzati per supportare un flusso di lavoro flessibile, continuo e scalabile. La fonte dei media può rappresentare un collo di bottiglia nell'espansione dei linfociti T presentando sfide tra cui la variabilità da lotto a lotto, che può influire negativamente sulla coerenza e sulla qualità dell'output del prodotto. L'utilizzo di un mezzo chimicamente definito e privo di siero da un fornitore affidabile con forti processi di controllo della qualità può aiutare a ridurre questa variabilità. Queste caratteristiche del prodotto ridurranno anche al minimo la purificazione a valle ei rischi normativi, oltre a ridurre i costi di produzione complessivi. L'influenza significativa dei media sull'espansione delle cellule T è stata dimostrata in un recente studio condotto utilizzando un nuovo mezzo di coltura sviluppato specificamente per l'espansione delle cellule T umane nei flussi di lavoro di terapia cellulare allogenica. Una delle principali sfide nei flussi di lavoro CAR T è la necessità di un numero maggiore di cellule con il fenotipo delle cellule T di memoria centrale più giovane preferito che si traduce in una maggiore funzionalità e risultati terapeutici efficaci. Aumenti modesti nelle celle di memoria centrali all'inizio della fase di espansione determinano rese cellulari maggiori al momento del raccolto. In questo studio, le cellule T di donatore sane sono state testate in un flusso di lavoro di tipo allogenico di 18 giorni, con i risultati che hanno dimostrato una proliferazione cellulare superiore di circa il 20% entro il giorno 10 e un aumento di quasi il 100% entro il giorno 17 utilizzando il terreno di nuova formulazione, rispetto a il mezzo di controllo. È stato anche dimostrato un aumento del 10-20% delle dimensioni del sottoinsieme di cellule T di memoria centrale desiderato quando normalizzato al mezzo di controllo. Inoltre, questo aumento delle cellule che mostrano un fenotipo di memoria precoce ha coinciso con un livello più elevato di rilascio di interferone gamma (IFNγ) quando vengono utilizzate cellule donatrici sane. Un aumento medio del 187% della produzione di IFNγ in 6 pazienti è stato dimostrato quando normalizzato al mezzo di controllo. L'aumento osservato probabilmente agirà da catalizzatore per migliorare la risposta immunitaria complessiva e fornire terapie più efficaci per i pazienti mediante la stimolazione di macrofagi, neutrofili e cellule natural killer. Non solo il mezzo ha un impatto sulla fase di espansione, ma i vantaggi dipendono e sono specifici della sorgente di celle iniziale utilizzata durante la fase di espansione. In questi studi, uno spostamento metabolico nelle cellule T ha consentito un flusso di lavoro più lungo.
Supplementi
Oltre al mezzo, anche gli integratori svolgono un ruolo importante nell'espansione delle cellule T. La L-glutammina è una fonte di carbonio essenziale per il metabolismo e la differenziazione che deve essere integrata durante il processo di produzione della terapia cellulare. Il siero è comunemente usato nella ricerca e può aiutare a supportare l'attivazione basale dei linfociti T e la crescita cellulare. Sebbene l'uso del siero possa essere accettabile per la ricerca, pone problemi di regolamentazione e fornitura per l'uso nelle applicazioni cliniche e può dimostrare la variabilità da lotto a lotto, che può influire sulla differenziazione dei linfociti T e sulla produzione complessiva del prodotto. La disponibilità di alternative sieriche sostitutive, che sono integratori definiti che hanno dimostrato di supportare rapporti comparabili di cellule T CD8⁺/CD4⁺ pur mantenendo un'elevata espansione e vitalità delle cellule, ha affrontato questi problemi.
Perfusione
La perfusione è una tecnica di bioelaborazione che prevede lo scambio continuo di mezzi esauriti con mezzi freschi, mantenendo le cellule all'interno del recipiente di coltura. Questo metodo rinfresca i nutrienti prevenendo l'accumulo di prodotti di scarto metabolici tossici che potrebbero avere un impatto negativo sulle prestazioni della coltura e sulla qualità del prodotto. Questa tecnologia consente alla coltura di raggiungere densità cellulari molto più elevate e l'espansione della piega all'interno di un ingombro ridotto e può portare a una maggiore produttività rispetto ai tradizionali processi batch o fed-batch. La perfusione è stata applicata all'espansione delle cellule T sia autologhe che allogeniche, ma è essenziale per la maggior parte dei flussi di lavoro allogenici, che richiedono una maggiore quantità di cellule. Il raggiungimento di una maggiore densità ed espansione delle cellule in un arco di tempo più breve può ridurre la popolazione delle cellule esaurite ed aumentare la popolazione delle cellule MTC più giovani, che sono note per supportare trattamenti più efficaci. Per valutare l'impatto della perfusione sulla crescita cellulare, sulla vitalità cellulare, sui metaboliti chiave e sui fattori di crescita è stato utilizzato un esperimento di espansione delle cellule T affiancato che confrontava i flussi di lavoro fed-batch e di perfusione nei bioreattori a movimento oscillante. La perfusione ha supportato una maggiore densità di cellule T vitali riducendo l'accumulo di lattato e ammoniaca durante l'espansione. Come con altri tipi cellulari, questi metaboliti sono tossici per le cellule T e possono indurre l'arresto della crescita cellulare o l'apoptosi, che ha un impatto diretto sulla vitalità e l'espansione cellulare.
Un'altra chiave per i flussi di lavoro allogenici è avere una concentrazione sufficiente di IL-2 per supportare la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T. Attraverso la perfusione, durante l'espansione è stato mantenuto un livello sufficiente di IL-2. Al contrario, la coltura non perfusa ha mostrato che la concentrazione di IL-2 scendeva a livelli non rilevabili entro il giorno 12, impedendo alle cellule di raggiungere una vitalità cellulare comparabile. Per comprendere appieno il ruolo della perfusione e dell'IL-2, è stato allestito un ulteriore esperimento per analizzare e confrontare la crescita cellulare e la vitalità con le configurazioni di perfusione e non perfusione. La quantità di IL-2 iniettata nel bioreattore senza perfusione di prova era equivalente a quella erogata al bioreattore di controllo della perfusione. Nonostante le iniezioni giornaliere equivalenti di IL-2, alla fine della fase di espansione delle cellule T (giorno 14), l'espansione della coltura senza perfusione era solo il 63% del controllo di perfusione. Sebbene la perfusione abbia i suoi vantaggi, l'elevato volume di mezzo di perfusione richiesto può essere costoso ed è imperativo che i produttori ottimizzino il loro processo e le velocità di perfusione per evitare sprechi medi. Detto questo, i vantaggi della tecnologia di perfusione sono innegabili per l'espansione delle cellule T; è una soluzione facilmente scalabile che può aiutare a mantenere un ambiente di coltura favorevole per flussi di lavoro più lunghi e produttivi particolarmente importanti per la terapia cellulare allogenica
Mantenimento della densità cellulare durante l'espansione
È stato dimostrato che parametri aggiuntivi della coltura cellulare, come la densità cellulare di mantenimento, influenzano l'espansione delle cellule T. I risultati di una recente valutazione degli impatti del mantenimento di diverse densità dei linfociti T hanno dimostrato numerosi effetti diretti sulla quantità e sulla qualità dei prodotti cellulari. Molti protocolli di espansione dei linfociti T classici richiedono il mantenimento delle cellule a 0,5 x 10⁶ cellule/mL; tuttavia, i risultati di questo studio hanno dimostrato che una densità cellulare inferiore di 0,25 x 10⁶ cellule/mL era correlata con un'espansione cellulare più elevata e una migliore vitalità. Al contrario, l'aumento della densità cellulare di mantenimento a 0,75 x 10⁶ cellule/mL ha dimostrato un'espansione di piega inferiore e una vitalità cellulare leggermente inferiore. Questi risultati suggeriscono che il mantenimento di una densità di cellule T inferiore può avere un impatto positivo sulla quantità e qualità della produzione cellulare esponendo le cellule T a più nutrienti e aiuta a mantenere un fenotipo di memoria centrale più ampio.
Restimolazione
Uno spostamento in corso verso il supporto della vitalità dei fenotipi delle cellule T desiderati ha creato interesse nella comprensione della durata della risposta suscitata dall'attivazione e dalla riattivazione nella fase di espansione. In uno studio recente, la "restimolazione" secondaria durante la fase di espansione è stata valutata utilizzando CTS Dynabeads CD3/CD28. L'obiettivo era comprendere meglio gli effetti della restimolazione dei linfociti T, come ha influenzato l'output delle cellule terapeutiche e se ha avuto un impatto sul processo di produzione dei linfociti T. Questo studio ha rivelato che un singolo ciclo di attivazione con le sfere non solo era sufficiente per indurre una robusta proliferazione cellulare e un'elevata vitalità nell'intero flusso di lavoro di 20 giorni, ma ha anche fornito prove che la restimolazione può causare un ritardo di crescita temporaneo e un calo della vitalità durante il giorni successivi. Inoltre, le cellule soggette ad attivazione secondaria hanno mostrato un rapporto CD8:CD4 inferiore e una forte downregulation dei biomarcatori delle cellule di memoria centrale. In entrambi i casi, con e senza restimolazione, vi è una netta diminuzione della popolazione della memoria centrale (CD62L⁺ CCR7⁺) ed un aumento della popolazione effettrice a doppio negativo (CD62L-CCR7-) nelle fasi successive di espansione, che è molto più pronunciato all'interno del gruppo restimolato.
Questi risultati suggeriscono che la restimolazione catalizza la transizione dei primi linfociti T della memoria in linfociti T effettori. Rallentare questa transizione è importante per lo sviluppo e la messa a punto dei processi di produzione delle cellule T. I risultati complessivi dello studio mostrano l'importanza fondamentale di scegliere il supporto ottimale, i supplementi, la piattaforma e i parametri di processo che supporteranno una robusta espansione dei linfociti T, pur mantenendo il fenotipo precoce dei linfociti T di memoria centrale desiderato, che è la chiave per terapie efficaci con linfociti T.
Test normativi e analitici
La conoscenza dei requisiti normativi è fondamentale per mantenere l'approvazione clinica in ogni fase per evitare problemi critici e ritardi nel passaggio alle fasi cliniche successive. Inoltre, i requisiti normativi influenzano molti dei requisiti di test di qualità analitica dei prodotti per terapia cellulare. Durante la fase di espansione, sono necessari strumenti analitici robusti e affidabili per misurare e monitorare con precisione varie caratteristiche cellulari come proliferazione, vitalità, stato di differenziazione ed altri attributi del fenotipo cellulare. Durante e dopo il processo di espansione, vengono eseguiti test per una serie di attributi di qualità richiesti con test approvati dall'organismo di regolamentazione o convalidati internamente. Questi test valutano gli attributi di qualità relativi alla sicurezza, purezza e potenza del prodotto cellulare. I test di sicurezza per la sterilità microbica e fungina e l'assenza di micoplasma, nonché i test per la replicazione di virus competenti e numero di copie vettoriali sono generalmente richiesti quando nel processo di produzione vengono utilizzati vettori virali. Il test di purezza viene spesso condotto con tecniche di citometria a flusso per valutare la proporzione di cellule positive per i rispettivi marcatori di superficie associati a cellule T e CAR, nonché test di sicurezza per assicurarsi che non siano presenti tipi cellulari indesiderati. Il test di potenza viene condotto per valutare il contenuto di cellule CAR T con citometria a flusso o metodi PCR, mentre la citotossicità e la secrezione di citochine vengono valutate con vari saggi in vitro. Esistono diversi modi per testare analiticamente una data caratteristica cellulare, pertanto la variabilità nei test presenta una nota fonte di variazione durante il processo di produzione.
Visione e considerazioni conclusive
Nell'ultimo decennio sono stati fatti molti progressi nel campo della terapia cellulare e ce ne sono molti altri in arrivo. Poiché il tempo è essenziale per le soluzioni terapeutiche del paziente, gli sforzi per ridurre la produzione e le tempistiche di rilascio della qualità dei prodotti sono un punto focale degli sforzi di ricerca e sviluppo. Il processo di produzione delle cellule T è complesso e attualmente esistono molte opportunità di variabilità in ogni fase. Sono in corso ulteriori ricerche per identificare e affrontare le variabili di produzione che possono influenzare gli attributi di qualità critici del prodotto finale. L'implementazione di una maggiore automazione, produzione di sistemi chiusi e caratterizzazione in tempo reale saranno probabilmente importanti sviluppi futuri. Ottenere soluzioni allogeniche "pronte all'uso" e migliorare le soluzioni terapeutiche autologhe per i pazienti richiede investimenti sostanziali nello sviluppo di prodotti e processi. Il lavoro in corso e in via di sviluppo per l'espansione delle cellule T comporta la mitigazione del rischio e lo sviluppo di un processo solido, più standardizzato e trasferibile. La chiave per rendere il viaggio dalla ricerca e sviluppo iniziale alla produzione commerciale il più semplice e senza soluzione di continuità possibile è una comprensione dettagliata dello sviluppo del prodotto e del processo per consentire un'espansione di successo. Altrettanto importante sarà l'innovazione nel campo per esplorare nuovi approcci ed espandere le tecnologie attualmente disponibili.
Una nota sulle terapie cellulari CAR NK
While CAR T therapies have demonstrated success in treatment of circulating blood-related cancers, utilizing engineered T cells for other cancers, such as solid tumors, has proven challenging. An approach under extensive development involves the use of NK cells, a cell subset of the innate immune system, which have been shown to be effective in a number of clinical trials for various cancer treatments. Allogeneic NK cells exert their cytotoxic effect in an antigen-and HLA-independent manner. Engineering of CAR NKs has facilitated specific targeting to tumor-specific antigens enabling them in a solid tumor microenvironment. This aspect combined with iPSC-derived CAR NK technologies could lead to an unlimited supply of cells as an off-the-shelf solution, bypassing long lead times for patients. Recent studies with CAR-NK-19 for lymphoid tumors (CD19) and CARNK-GPC3 for solid tumors of hepatocellular carcinoma (HCC) and ovarian cancers demonstrate the promise of this approach. The workflow to generate CAR NK cells is similar to that of CAR T cells but involves sufficient ex vivo expansion of NK cell cultures to meet dose and lot size requirements for allogeneic therapies. Typically, each dose requires approximately 5 x 10⁶ cells/kg of body weight, or nearly 500 x 10⁶ cells per person. The cell culture platforms that are used for ex vivo expansion of CAR-NK cells include T-flasks, G-Rex vessels, bioreactors, or culture bags depending on scale of final clinical product. Recommended culture conditions include use of a xeno-free medium supplemented with IL-2, IL-15, and IL-21. As is the case with CAR T cells, extensive QC requirements precede the use of CAR NK cells in a clinical setting, and often include testing the cell product for its cytotoxic killing abilities on various tumor cell lines in vivo animal tumor models.
Da:
https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Thermo/Mariskka/2022%20SQL%20Campaign/cell-therapy-handbook-thermo-fisher-1.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1662305877070.1662328034545.108&__hssc=8807082.1.1662328034545&__hsfp=1418904915&hsCtaTracking=5ecb48c7-b247-4faf-be12-b0ce69caca78%7Ce6d6986c-d41a-473f-ba60-61a59c5d0605
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