EVALUATION OF HISTAMINE CONCENTRATIONS IN HUMAN BASOPHIL CULTURE SUPERNATANTS / VALUTAZIONE DELLE CONCENTRAZIONI DI ISTAMINA NEI SUPERNATANTI DELLA COLTURA DI BASOFILI UMANI

EVALUATION OF HISTAMINE CONCENTRATIONS IN HUMAN BASOPHIL CULTURE SUPERNATANTS / VALUTAZIONE DELLE CONCENTRAZIONI DI ISTAMINA NEI SUPERNATANTI DELLA COLTURA DI BASOFILI UMANI

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1: Activation of IL-3–primed basophils by IVIG is not associated with degranulation. Amount of histamine in culture supernatants (means 6 SEMs, n 5 5 donors). ns, Not significant, 1-way ANOVA with Tukey multiple comparison tests. / L'attivazione dei basofili innescati con IL-3 da parte di IVIG non è associata alla degranulazione. Quantità di istamina nei supernatanti di coltura (significa 6 SEM, n 5 5 donatori). ns, ANOVA a 1 via non significativa con test di confronto multiplo di Tukey.

CONTEXT

Intravenous immunoglobulin (IVIG) is commonly used to treat auto-immune diseases and systemic inflammatory diseases. IVIG contains normal IgG molecules and is prepared from the pooled plasmas of healthy donors. High doses of IVIG therapy have been shown to have antiinflammatory effects. Basophils are a type of white blood cells that are responsible for inflammatory reactions during the immune response, and also produce inflammatory mediators such as histamine and serotonin. Recently, it has been reported that, in autoimmune and systemic inflammatory disease models, the anti-inflammatory effects of IVIG are mediated through basophils. The objective of this study was to evaluate the effect of IVIG on human basophil functions. Briefly, circulating basophils were isolated from healthy donors and cultured in the presence of several cytokines and IVIG. The effects of IVIG were evaluated based on several inflammatory biomarkers, including histamine release. The effects of IVIG were first examined on resting basophils, but no effects were found, which indicates that resting basophils are not the target for IVIG. Then, the effects of IVIG were investigated on basophils that were stimulated with IL-3 (interleukine-3), the major basophil-priming cytokine. The Bertin Bioreagent Histamine ELISA kit (Bertin Bioreagent, Montigny-le-Bretonneux, France) was used to measure histamine levels in culture supernatants of IL-3-primed human basophils.

 PROTOCOL

 Isolation and culture of basophils: Basophils were isolated from PBMCs of healthy donors’ buffy bags (Centre Necker-Cabanel, EFS, Paris; INSERM-EFS ethical permission nos. 12/EFS/079 and 18/EFS/033) by using the Basophil Isolation Kit II (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) and autoMACS (Miltenyi Biotec). The purity of basophils based on expression of FcεRI and CD123 was approximately 97%. Cells (0.1x106 cells/well per 200 mL) were cultured in 96-well U-bottomed plate either alone in serumfree X-VIVO 15 medium, with IL-3 (100 ng/mL; ImmunoTools, Friesoythe, Germany), or with IL-3 plus IVIG (25 mg/mL) or human serum albumin (HSA; 10 mg/mL; LFB, Les Ulis, France) or F(ab’)2 fragments (16 mg/mL) or Fc fragments (9 mg/mL) for 24 hours to investigate the effect of IVIG on IL-3–primed basophils. Also, basophils were sequentially stimulated with IL-3 and IL-33 for 1 hour each and cultured with IVIG or HSA for an additional 22 hours. 

• Measurement of histamine levels: Histamine levels were measured in culture supernatants by using the Histamine EIA Kit (Bertin Bioreagent, Montigny-le-Bretonneux, France). Results can be found in Figure 1.

 • Statistical analysis: Statistical analysis was performed with Prism 6 software (GraphPad Software, La Jolla, Calif). One-way ANOVA (with Tukey multiple comparison tests or Dunnett multiple comparison tests), and 2-way Mann-Whitney tests were used to determine statistical significance

ITALIANO

CONTESTO

L'immunoglobulina endovenosa (IVIG) è comunemente usata per trattare le malattie autoimmuni e le malattie infiammatorie sistemiche. L'IVIG contiene normali molecole di IgG e viene preparata dai plasmi riuniti di donatori sani. È stato dimostrato che alte dosi di terapia con IVIG hanno effetti antinfiammatori. I basofili sono un tipo di globuli bianchi responsabili delle reazioni infiammatorie durante la risposta immunitaria e producono anche mediatori dell'infiammazione come l'istamina e la serotonina. Recentemente, è stato riportato che, nei modelli di malattie infiammatorie autoimmuni e sistemiche, gli effetti antinfiammatori delle IVIG sono mediati dai basofili. L'obiettivo di questo studio era di valutare l'effetto delle IVIG sulle funzioni dei basofili umani. In breve, i basofili circolanti sono stati isolati da donatori sani e coltivati ​​in presenza di diverse citochine e IVIG. Gli effetti delle IVIG sono stati valutati sulla base di diversi biomarcatori infiammatori, incluso il rilascio di istamina. Gli effetti delle IVIG sono stati esaminati per la prima volta sui basofili a riposo, ma non è stato riscontrato alcun effetto, il che indica che i basofili a riposo non sono l'obiettivo delle IVIG. Quindi, gli effetti delle IVIG sono stati studiati sui basofili che sono stati stimolati con IL-3 (interleuchina-3), la principale citochina di innesco dei basofili. Il kit Bertin Bioreagent Histamine ELISA (Bertin Bioreagent, Montigny-le-Bretonneux, Francia) è stato utilizzato per misurare i livelli di istamina nei supernatanti di coltura di basofili umani innescati con IL-3.

PROTOCOLLO

Isolamento e coltura dei basofili: i basofili sono stati isolati dai PBMC di buffy bag di donatori sani (Centre Necker-Cabanel, EFS, Parigi; autorizzazione etica INSERM-EFS n. 12/EFS/079 e 18/EFS/033) utilizzando il basofilo Kit di isolamento II (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania) e autoMACS (Miltenyi Biotec). La purezza dei basofili basata sull'espressione di FcεRI e CD123 era di circa il 97%. Le cellule (0,1x106 cellule/pozzetto per 200 mL) sono state coltivate in una piastra con fondo a U da 96 pozzetti da sole in mezzo di X-VIVO 15 privo di siero, con IL-3 (100 ng/mL; ImmunoTools, Friesoythe, Germania) o con IL-3 più IVIG (25 mg/mL) o sieroalbumina umana (HSA; 10 mg/mL; LFB, Les Ulis, Francia) o frammenti F(ab')2 (16 mg/mL) o frammenti Fc (9 mg /mL) per 24 ore per studiare l'effetto di IVIG sui basofili innescati con IL-3. Inoltre, i basofili sono stati stimolati in sequenza con IL-3 e IL-33 per 1 ora ciascuno e coltivati ​​con IVIG o HSA per ulteriori 22 ore.

• Misurazione dei livelli di istamina: i livelli di istamina sono stati misurati nei supernatanti di coltura utilizzando il kit EIA dell'istamina (Bertin Bioreagent, Montigny-le-Bretonneux, Francia). I risultati possono essere trovati nella Figura 1.

 • Analisi statistica: l'analisi statistica è stata eseguita con il software Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, California). Per determinare la significatività statistica sono stati utilizzati ANOVA unidirezionale (con test di confronto multiplo di Tukey o test di confronto multiplo di Dunnett) e test di Mann-Whitney a 2 vie

Da:

file:///C:/Users/User/Downloads/BIOR_White-Paper_Histamine.pdf