Flow Cytometry Common Applications and New Technology /Applicazioni comuni della Citometria a flusso e nuove tecnologie
Flow Cytometry Common Applications and New Technology /Applicazioni comuni della Citometria a flusso e nuove tecnologie
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Fig. 45. Immunophenotyping of whole blood. A simple nine-color immunophenotyping panel using CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD25, CD45, and CD127 to identify T cell, B cell, granulocyte, and monocyte lineages and subsets. Axxx, Alexa Fluor; FSC, forward scatter; PE, phycoerythrin; SBUV, StarBright UltraViolet; SBV, StarBright Violet; SSC, side scatter; Treg, T regulatory. / Immunofenotipizzazione del sangue intero. Un semplice pannello di immunofenotipizzazione a nove colori che utilizza CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD25, CD45 e CD127 per identificare lignaggi e sottoinsiemi di cellule T, cellule B, granulociti e monociti. Axxx, Alexa Fluorescente; FSC, dispersione in avanti; PE, ficoeritrina; SBUV, StarBright UltraViolet; SBV, StarBright Violet; SSC, dispersione laterale; Treg, T regolatorio
Immunophenotyping
Flow cytometry is routinely used to identify cell markers, particularly within the immune system. This application is called immunophenotyping, and the need to identify increasing numbers of markers has driven the growth in multiplexing in multicolor flow cytometry. Immunophenotyping can simply involve identifying a cell by a single marker. More complex immunophenotyping includes the identification of cells using multiple markers, including homing profiles, activation states, and cytokine release, all in one panel. As a consequence, experimental protocols are often a combination of surface and intracellular staining. In addition to basic research, immunophenotyping is routinely used in clinical applications to diagnose disease or monitor and evaluate residual disease. A simple example of immunophenotyping using surface staining is shown in Figure 45, where a nine-color staining panel was used to identify major cell subsets in human peripheral blood. Additional information in a more complex panel may include the naïve, memory, or activation status of these lineages (using markers like CD45RA, CD45RO, CD27, CD57, CD62L, and CD69), or their cytokine profile (using markers like IFN- , IL-2, IL-17, and IL-9). It is easy to see how a much larger panel can be quickly built. In fact, in conventional flow cytometry, panels are approaching 30 colors. In full spectrum flow cytometry, panels have surpassed 40 colors and will expand with the release of new fluorescent dyes, including StarBright Dyes.
Cell Sorting
Another common use of flow cytometry is cell sorting based on scatter and/or fluorescence properties, either from fluorescent protein expression or from cells stained by fluorescently labeled antibodies. Instruments capable of separating six populations at a time are now available, and many instruments are capable of sorting cells into populations with shared characteristics or into wells containing one cell only. Furthermore, in addition to conventional flow cytometry, full spectrum cell sorters have now been released, allowing the use of novel fluorescent dye combinations, removal of autofluorescence, and easier separation of fluorescent proteins. Sorting of single cells or cell populations allows purification and enrichment for downstream processing in other applications, like PCR or RNA sequencing (RNAseq), or the selection of cells for culturing. There are also uses in immunological research, physiological research, and protein and cell engineering.
Regulated Cell Death
Regulated cell death is the overarching term for the many mechanisms by which a cell can undergo programmed death that is not necrosis. It can be in response to many processes, for example development, tissue homeostasis, and host defense. Several of these processes can be measured by flow cytometry, including apoptosis, autophagy, and pyroptosis. Apoptosis is a highly regulated process that plays an important role in embryogenesis, maintaining an organism’s size, and eliminating damaged cells. The importance of apoptosis in human health is underscored by the many diseases that result from aberrant apoptosis. Dysregulation of apoptosis has been linked to various cancers, neurological and cardiovascular disorders, and autoimmune diseases. One of the most common features of apoptosis that can be measured by flow cytometry is externalization of phosphatidylserine (PS), a phospholipid found in the inner membrane of healthy cells, which increases during apoptosis. Annexin V binds to phosphatidylserine and thus annexin V labeled with fluorophores allows apoptosis to be assessed, usually in combination with a viability dye like PI, to distinguish apoptotic from necrotic cells. Healthy cells are negative for both markers, apoptotic cells are positive for annexin V, and necrotic cells are positive for both markers. When Jurkat T cells are treated with staurosporine, they undergo apoptosis, followed by necrosis (Figure 46).
Fig. 46. Annexin V staining to measure apoptosis. Jurkat cells were treated with staurosporine at 1 µM for 0 hr and 6 hr to induce apoptosis. The cells were then stained with Annexin V FITC and ReadiDrop Propidium Iodide. Apoptotic cells positive for annexin V can be seen in the bottom right quadrant and necrotic positive for both annexin and PI in the top right quadrant. Healthy cells are negative for both stains. FITC, fluorescein isothiocyanate; PI, propidium iodide. / Colorazione con annessina V per misurare l'apoptosi. Le cellule Jurkat sono state trattate con staurosporina a 1 µM per 0 ore e 6 ore per indurre l'apoptosi. Le cellule sono state quindi colorate con Annexin V FITC e ReadiDrop Propidium Iodide. Le cellule apoptotiche positive per l'annessina V possono essere viste nel quadrante in basso a destra e necrotiche positive sia per l'annessina che per il PI nel quadrante in alto a destra. Le cellule sane sono negative per entrambe le macchie. FITC, isotiocianato di fluoresceina; PI, ioduro di propidio.
Because PS externalization is a dynamic, reversible process until a cell is committed to apoptosis after mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP), annexin V conjugates are unable to distinguish early from late apoptosis. Polarity-sensitive indicator of viability and apoptosis (pSIVA) probes are biosensors that reversibly bind to PS, and thus turn on and off as PS flips from the outer membrane to the inner membrane. This allows easy comparison of differences in apoptosis rates in response to different experimental treatments in real time. DNA fragmentation, which occurs during the late stages of apoptosis, can also be measured by flow cytometry using the sub-G1 assay. The small, ~180 bp DNA fragments generated during apoptosis leak out of cells, decreasing the total DNA content of apoptotic cells. By staining DNA with PI, hypodiploid apoptotic cells can be counted in the sub-G1 peak of the PI histogram. Staining with DNA markers will also allow measurement of cell shrinkage in combination with a reduction in the FSC signal. Early apoptosis can also be measured by potentiomic dyes that assess the reduced mitochondrial potential of cells. Examples of these include tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE), tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), and JC-1. These lipophilic dyes aggregate in mitochondria of nonapoptotic cells and brightly fluoresce. When the mitochondrial membrane potential collapses, the dye disperses into the cytoplasm in its monomeric form, leading to reduced fluorescence or a change in color. These dyes can be combined with other apoptosis markers, such as fluorophore labeled inhibitor of caspase assays (FLICA), which fluoresce in the presence of caspase and with antibodies against specific caspases. Pyroptosis, mediated by caspase-1, can also be measured using FLICA assays (Figure 47).
Autophagy plays a critical role in maintaining cellular homeostasis by protein degradation and turnover of damaged cell organelles. The process has a complex dual role, affecting both cell survival and death. It is crucial to the maintenance of a healthy cell, but under certain circumstances autophagy-dependent cell death (ADCD) can occur. Autophagy can be difficult to detect, often requiring the use of orthogonal techniques for confirmation. It is measured using flow cytometry in two different ways. The first method involves detection of lipidation of LC3-I to LC3-II and LC3-II’s subsequent movement from the cytosol to the membrane of autophagosomes. The second method uses cell permeant, aliphatic fluorescent dyes that label autophagosomes and autolysosomes. Signal is often weak, especially in primary cells, but inhibition of lysosomal proteases, by using bafilomycin, for example, provides a way of increasing the signal (Figure 48).
Fig. 48. Autophagy induction in Jurkat cells measured with Autophagy Probe Red. Jurkat cells were either untreated for basal conditions (red), treated with 0.5 μM rapamycin for 18 hr (blue), or treated with 0.5 μM rapamycin for 18 hr followed by 10 nM bafilomycin A1 for 2 hr (orange). / Induzione dell'autofagia nelle cellule Jurkat misurata con Autophagy Probe Red. Le cellule Jurkat non sono state trattate per condizioni basali (rosse), trattate con 0,5 μM di rapamicina per 18 ore (blu) o trattate con 0,5 μM di rapamicina per 18 ore seguite da 10 nM di bafilomicina A1 per 2 ore (arancione).
Proliferation Cell proliferation can be measured by flow cytometry using different methods:
■ Detecting changes in the forward and side scatter, indicating changes in the cell cycle. This is a simple method but not always the most accurate
■ Staining with an antibody against a proliferation marker (Ki67, MCM2, and PCNA are a few examples)
■ Using a TUNEL assay. After incubating cells with BrdU, which is incorporated into DNA during the S phase of the cell cycle, BrdU can be detected using fluorescently labeled anti-BrdU antibodies. When combined with a DNA stain, including PI or DAPI, the relative proportion of cells in S phase can be determined
■ Using cytoplasmic dyes like CFSE or CytoTrack. Cells are incubated with the protein binding dyes and as the labeled cells divide, the concentration of the dye is halved and the proliferation measured based upon the reduced levels of fluorescence in subsequent generations (Figure 49). These dyes are nontoxic, do not require cell fixation, and are available in a wide variety of colors. These features make it possible to combine the dyes for immunophenotyping
Fig. 49. Measuring proliferation using CytoTrack Assay Kit. Human peripheral blood lymphocytes were stained with CytoTrack Red 628/643 Cell Proliferation Assay Kit (#1351205) and stimulated for 5 days with phytohemagglutinin (PHA). Cells that have proliferated show a reduction in the amount of dye with each cell division. You can see stimulated cells (red), labeled but unstimulated cells (green), and unlabeled cells (blue). Six red peaks corresponding to each division are visible in this experiment. Data were acquired on the ZE5 Cell Analyzer / Misurazione della proliferazione utilizzando il kit di analisi CytoTrack. I linfociti del sangue periferico umano sono stati colorati con CytoTrack Red 628/643 Cell Proliferation Assay Kit (n. 1351205) e stimolati per 5 giorni con fitoemoagglutinina (PHA). Le cellule che hanno proliferato mostrano una riduzione della quantità di colorante ad ogni divisione cellulare. Puoi vedere cellule stimolate (rosse), cellule etichettate ma non stimolate (verdi) e cellule non etichettate (blu). In questo esperimento sono visibili sei picchi rossi corrispondenti a ciascuna divisione. I dati sono stati acquisiti sull'analizzatore cellulare ZE5
Cell Cycle
The proportion of cells within each stage of the cell cycle can be determined using DNA binding dyes that bind in a stoichiometric manner. Common examples include PI, 7-AAD, Hoechst 33342, and DAPI. When using this method, cells in the G2 phase, which have twice as much DNA as cells in G1, will fluoresce twice as brightly. To ensure good staining, the cells should be fixed in cold 70% (v/v) ethanol. However, this can interfere with other staining protocols. Cell cycle analysis is usually measured on a linear scale, unlike most flow cytometry, which uses a logarithmic scale, because the differences in fluorescence are usually smaller. It is important to gate out any doublets from the data and the data can be improved by using a low flow rate on the cytometer. Many flow cytometry software programs offer algorithms to accurately estimate the cell cycle phases.
Signaling and Phosphoflow
In addition to the expression of surface molecules, there is a lot of interest in cellular activation states and measuring signaling cascades. Flow cytometry offers a quick and effective way to measure signaling at a specific time point in individual cells. The staining methods for detecting signaling molecules and phosphorylated proteins (phosphoflow) using antibodies may differ from normal intracellular staining, and specific experimental controls may be required. For signaling and phosphoflow, cells need to be rapidly fixed to avoid dephosphorylation, and stronger permeabilization methods may be required to ensure permeabilization of the nuclear membrane. As with cell cycle staining, fixation and permeabilization may alter your ability to measure cell surface molecules. Signaling can be measured using dyes that fluoresce in response to changes in calcium. Typically, cells are loaded with calcium indicator dyes, such as indo-1, to determine a baseline level of signaling. They are then stimulated and the change in fluorescence denotes a change in intracellular calcium levels.
Small Particle Detection
An increasing variety of small particles can be studied using flow cytometry. Small particles can include platelets, which are typically 2–3 μm in diameter; bacteria, which can range from 0.3–5 μm; cellular extravesicles, which can be further split into apoptotic bodies, microvesicles; and exosomes, the smallest of which are as little as 50 nm in diameter. Although they do not have the refractive index of exosomes, beads can be used to help set up instrumentation to detect small particles (Figure 50). Exosomes are mostly composed of cytoskeletal proteins, mRNA, microRNA, and actin receptors. They are important in crosstalk and regulation of cells because they transfer proteins and RNA between cells. They can be identified by forward and side scatter, but a logarithmic scale is required for adequate separation. Detection of these particles can be problematic because they are often smaller than the wavelength of light used to detect them. Light scatter depends on particle diameter, among other factors, and it is difficult to detect particles smaller than the wavelength.
To study small particles, cytometers like the Bio-Rad ZE5 Cell Analyzer have been developed with extra PMT detectors in the forward scatter from shorter wavelength lasers, and the trigger for data collection changed from FSC to a fluorescent signal or multiple fluorescent markers. Alternative methods for enhanced detection include using shorter light wavelengths, as this generally results in increased scatter, and antibody coated beads to increase the size of the particle being detected. Care should be taken to reduce the noise by filtering the sheath fluid, as it may mask signal, and carefully setting the threshold level, so as not to exclude the exosomes. It should be noted that as the particles decrease in size, antigen availability will also decrease, leading to reduced sensitivity or resolution.
Gene Expression and Transfection
Fluorescent proteins are widely used in flow cytometry to determine gene expression and transfection efficiency in live and fixed cells. They are particularly useful when performing cell sorting experiments. They can be reporters of transcription factors, promoter activity, and cellular expression patterns, as well as screening for RNAi and CRISPR activity, due to the high-throughput capacity of flow cytometry. Fluorescent proteins can also be photoactivatable, photoswitchable, and suitable for FRET experiments. Initially only available as green fluorescent protein (GFP), there are now over a hundred fluorescent proteins that excite and emit at various wavelengths, making them perfect for multicolor flow cytometry.
Absolute Quantification
Although flow cytometry can quantify marker expression on and in cells, it does not provide information on the cell concentration or absolute quantification. To overcome this, fluorescent beads can be added and counted. If a known concentration of beads is added to your sample, the number of beads collected will be proportional to the number of cells. Some cytometers can give accurate cell counts by measuring the volume of sample acquired, and in this case, the number of cells per microliter can be measured.
Particle Internalization
Internalization of particles, cell surface markers, and antigens can occur through phagocytosis. Flow cytometry has proved to be an effective method of quantifying the phagocytosis of fluorescently labeled particles. Dyes that either alter their fluorescent characteristics when internalized or quench surfacebound fluorescence can be used to distinguish between surface and internalized particles. Fluorescence
In Situ Hybridization and RNA Detection
Fluorescence in situ hybridization (FISH) using flow cytometry was first demonstrated in the late 1990s to determine telomere length. Fluorescent nucleic acid probes were used to highlight specific repeat sequences and then fluorescence was measured using specific software. Since then, RNA expression protocols that allow quantification of mRNA levels have been developed. FISH is a powerful tool, as it can be performed in combination with surface staining to identify specific cells and subsets, whereas quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) will give information only on a cell population, despite being very sensitive.
Innovations in Cytometry
Flow cytometry has become more accessible to researchers through a reduction in the complexity of instrument setup, true automation, increased sensitivity, and more user-friendly software. Large experiments can now be run and analyzed without the need for specialized training. These innovations include:
■ Artificial intelligence, which has made multiparameter analysis and downstream processing more reliable, removing bias and eliminating errors in manual gating
■ Smaller and yet more powerful instrumentation featuring increased numbers of lasers and filters
■ Imaging flow cytometry, which uses a CCD camera to capture images of particles as cells pass through the laser. Multiple (spectrally different) images can be captured simultaneously, allowing composites to be made and antigen locations to be determined
■ StarBright Dyes, which are high-quality fluorescent dyes with unique spectra that allow larger panels to be built Mass cytometry (also known as cytometry by time of flight [CyTOF]) is another innovation in cytometry. The technique relies on labeling the samples with antibodies bound to metal isotopes, which can then be measured by analyzing the time each isotope takes to pass through an electric field toward the detector. Mass cytometry has the ability to detect signals in over 130 channels, significantly increasing multiplexing capability; however, as not all the channels can be currently used, panel size is limited to around 50 markers. Mass cytometry has undergone substantial recent innovations, including the development of Imaging Mass Cytometry. Using this technique, thin tissue slices can be stained and analyzed. A 1 µm laser beam focused on the sample collects the antibodies tagged with the metals and directs them for detection using the CyTOF technology. Using this system, up to 37 markers can be detected and resolved simultaneously. Mass cytometry allows more markers to be simultaneously identified than regular flow cytometry, and Imaging Mass Cytometry allows more markers to be detected than microscopy. But there are some downsides. The larger the isotope, the longer it takes to pass through the electric field, and the sample acquisition is quite slow. In addition, a specialized analysis software is required and analysis can be problematic and time-consuming. The imaging resolution of Imaging Mass Cytometry is lower than that of microscopy, such that no fine cellular details can be quantified. A similar technology to Imaging Mass Cytometry is multiplexed ion beam imaging (MIBI) technology. This also uses antibodies tagged with monoisotopic metal tags to visualize tissue sections but does not ablate. It can visualize over 40 markers simultaneously and is able to resolve cellular structures up to 250 nm.
ITALIANO
Immunofenotipizzazione
La citometria a flusso viene utilizzata di routine per identificare i marcatori cellulari, in particolare all'interno del sistema immunitario. Questa applicazione è chiamata immunofenotipizzazione e la necessità di identificare un numero crescente di marcatori ha guidato la crescita del multiplexing nella citometria a flusso multicolore. L'immunofenotipizzazione può semplicemente implicare l'identificazione di una cellula mediante un singolo marcatore. L'immunofenotipizzazione più complessa include l'identificazione di cellule utilizzando più marcatori, inclusi profili di homing, stati di attivazione e rilascio di citochine, il tutto in un unico pannello. Di conseguenza, i protocolli sperimentali sono spesso una combinazione di colorazione superficiale ed intracellulare. Oltre alla ricerca di base, l'immunofenotipizzazione viene utilizzata di routine nelle applicazioni cliniche per diagnosticare malattie o monitorare e valutare la malattia residua. Un semplice esempio di immunofenotipizzazione mediante colorazione superficiale è mostrato nella Figura 45, in cui è stato utilizzato un pannello di colorazione a nove colori per identificare i principali sottoinsiemi di cellule nel sangue periferico umano. Ulteriori informazioni in un pannello più complesso possono includere l'ingenuità, la memoria o lo stato di attivazione di questi lignaggi (usando marcatori come CD45RA, CD45RO, CD27, CD57, CD62L e CD69) o il loro profilo di citochine (usando marcatori come IFN-, IL -2, IL-17 e IL-9). È facile vedere come si possa costruire rapidamente un pannello molto più grande. Infatti, nella citometria a flusso convenzionale, i pannelli si stanno avvicinando a 30 colori. Nella citometria a flusso a spettro completo, i pannelli hanno superato i 40 colori e si espanderanno con il rilascio di nuovi coloranti fluorescenti, inclusi i coloranti StarBright..
Ordinamento delle celle
Un altro uso comune della citometria a flusso è l'ordinamento cellulare basato su proprietà di dispersione e/o fluorescenza, dall'espressione di proteine fluorescenti o da cellule colorate da anticorpi marcati in modo fluorescente. Sono ora disponibili strumenti in grado di separare sei popolazioni alla volta e molti strumenti sono in grado di ordinare le cellule in popolazioni con caratteristiche condivise o in pozzetti contenenti una sola cellula. Inoltre, oltre alla citometria a flusso convenzionale, sono stati ora rilasciati selezionatori cellulari a spettro completo, che consentono l'uso di nuove combinazioni di coloranti fluorescenti, la rimozione dell'autofluorescenza ed una più facile separazione delle proteine fluorescenti. L'ordinamento di singole cellule o popolazioni cellulari consente la purificazione e l'arricchimento per l'elaborazione a valle in altre applicazioni, come la PCR o il sequenziamento dell'RNA (RNAseq) o la selezione di cellule per la coltura. Ci sono anche usi nella ricerca immunologica, nella ricerca fisiologica e nell'ingegneria cellulare e proteica.
Morte cellulare regolata
La morte cellulare regolata è il termine generale per i molti meccanismi attraverso i quali una cellula può subire una morte programmata che non è necrosi. Può essere in risposta a molti processi, ad esempio lo sviluppo, l'omeostasi dei tessuti e la difesa dell'ospite. Molti di questi processi possono essere misurati mediante citometria a flusso, tra cui l'apoptosi, l'autofagia e la pirotosi. L'apoptosi è un processo altamente regolato che svolge un ruolo importante nell'embriogenesi, nel mantenimento delle dimensioni di un organismo e nell'eliminazione delle cellule danneggiate. L'importanza dell'apoptosi nella salute umana è sottolineata dalle numerose malattie che derivano dall'apoptosi aberrante. La disregolazione dell'apoptosi è stata collegata a vari tipi di cancro, disturbi neurologici e cardiovascolari e malattie autoimmuni. Una delle caratteristiche più comuni dell'apoptosi che può essere misurata mediante citometria a flusso è l'esternalizzazione della fosfatidilserina (PS), un fosfolipide presente nella membrana interna delle cellule sane, che aumenta durante l'apoptosi. L'annessina V si lega alla fosfatidilserina e quindi l'annessina V marcata con fluorofori consente di valutare l'apoptosi, solitamente in combinazione con un colorante di vitalità come il PI, per distinguere le cellule apoptotiche da quelle necrotiche. Le cellule sane sono negative per entrambi i marcatori, le cellule apoptotiche sono positive per l'annessina V e le cellule necrotiche sono positive per entrambi i marcatori. Quando i linfociti T Jurkat vengono trattati con staurosporina, vanno incontro a apoptosi, seguita da necrosi (Figura 46).
Poiché l'esternalizzazione del PS è un processo dinamico e reversibile fino a quando una cellula non è impegnata nell'apoptosi dopo la permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale (MOMP), i coniugati dell'annessina V non sono in grado di distinguere l'apoptosi precoce dall'apoptosi tardiva. Le sonde dell'indicatore di vitalità e apoptosi (pSIVA) sensibili alla polarità sono biosensori che si legano in modo reversibile al PS e quindi si accendono e si spengono quando il PS si sposta dalla membrana esterna alla membrana interna. Ciò consente un facile confronto delle differenze nei tassi di apoptosi in risposta a diversi trattamenti sperimentali in tempo reale. La frammentazione del DNA, che si verifica durante le ultime fasi dell'apoptosi, può anche essere misurata mediante citometria a flusso utilizzando il test sub-G1. I piccoli frammenti di DNA di circa 180 bp generati durante l'apoptosi fuoriescono dalle cellule, diminuendo il contenuto totale di DNA delle cellule apoptotiche. Colorando il DNA con PI, le cellule apoptotiche ipodiploidi possono essere contate nel picco sub-G1 dell'istogramma PI. La colorazione con marcatori del DNA consentirà anche la misurazione del restringimento cellulare in combinazione con una riduzione del segnale FSC. L'apoptosi precoce può anche essere misurata da coloranti potenziomici che valutano il ridotto potenziale mitocondriale delle cellule. Esempi di questi includono tetrametilrodamina etil estere (TMRE), tetrametilrodamina metil estere (TMRM) e JC-1. Questi coloranti lipofili si aggregano nei mitocondri delle cellule non apoptotiche e hanno una fluorescenza brillante. Quando il potenziale della membrana mitocondriale collassa, il colorante si disperde nel citoplasma nella sua forma monomerica, portando a una fluorescenza ridotta oa un cambiamento di colore. Questi coloranti possono essere combinati con altri marcatori di apoptosi, come l'inibitore marcato con fluoroforo dei saggi delle caspasi (FLICA), che emettono fluorescenza in presenza di caspasi e con anticorpi contro specifiche caspasi. La pirotosi, mediata dalla caspasi-1, può anche essere misurata utilizzando i test FLICA (Figura 47).
L'autofagia svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare mediante la degradazione delle proteine e il turnover degli organelli cellulari danneggiati. Il processo ha un duplice ruolo complesso, che colpisce sia la sopravvivenza che la morte cellulare. È fondamentale per il mantenimento di una cellula sana, ma in determinate circostanze può verificarsi la morte cellulare dipendente dall'autofagia (ADCD). L'autofagia può essere difficile da rilevare, spesso richiedendo l'uso di tecniche ortogonali per la conferma. Viene misurato utilizzando la citometria a flusso in due modi diversi. Il primo metodo prevede il rilevamento della lipidazione da LC3-I a LC3-II e il successivo movimento di LC3-II dal citosol alla membrana degli autofagosomi. Il secondo metodo utilizza coloranti fluorescenti alifatici permeanti cellulari che etichettano gli autofagosomi e gli autolisosomi. Il segnale è spesso debole, specialmente nelle cellule primarie, ma l'inibizione delle proteasi lisosomiali, ad esempio utilizzando la bafilomicina, fornisce un modo per aumentare il segnale (Figura 48).
Proliferazione La proliferazione cellulare può essere misurata mediante citometria a flusso utilizzando diversi metodi:
■ Rilevare i cambiamenti nella dispersione frontale e laterale, indicando i cambiamenti nel ciclo cellulare. Questo è un metodo semplice ma non sempre il più accurato
■ Colorazione con un anticorpo contro un marcatore di proliferazione (Ki67, MCM2 e PCNA sono alcuni esempi)
■ Utilizzo di un test TUNEL. Dopo aver incubato le cellule con BrdU, che è incorporato nel DNA durante la fase S del ciclo cellulare, BrdU può essere rilevato utilizzando anticorpi anti-BrdU fluorescenti. Se combinato con una colorazione del DNA, inclusi PI o DAPI, è possibile determinare la proporzione relativa di cellule in fase S
■ Utilizzo di coloranti citoplasmatici come CFSE o CytoTrack. Le cellule vengono incubate con i coloranti che legano le proteine e quando le cellule etichettate si dividono, la concentrazione del colorante viene dimezzata e la proliferazione misurata in base ai livelli ridotti di fluorescenza nelle generazioni successive (Figura 49). Questi coloranti non sono tossici, non richiedono fissazione cellulare e sono disponibili in un'ampia varietà di colori. Queste caratteristiche consentono di combinare i coloranti per l'immunofenotipizzazione
Ciclo cellulare
La proporzione di cellule all'interno di ciascuna fase del ciclo cellulare può essere determinata utilizzando coloranti che legano il DNA che si legano in modo stechiometrico. Esempi comuni includono PI, 7-AAD, Hoechst 33342 e DAPI. Quando si utilizza questo metodo, le cellule nella fase G2, che hanno il doppio del DNA delle cellule in G1, emetteranno una fluorescenza doppia. Per garantire una buona colorazione, le cellule devono essere fissate in etanolo freddo al 70% (v/v). Tuttavia, questo può interferire con altri protocolli di colorazione. L'analisi del ciclo cellulare viene solitamente misurata su scala lineare, a differenza della maggior parte della citometria a flusso, che utilizza una scala logaritmica, poiché le differenze di fluorescenza sono generalmente più piccole. È importante eliminare eventuali doppietti dai dati e i dati possono essere migliorati utilizzando una bassa portata sul citometro. Molti programmi software di citometria a flusso offrono algoritmi per stimare con precisione le fasi del ciclo cellulare.
Segnalazione e fosfoflusso
Oltre all'espressione delle molecole di superficie, c'è molto interesse per gli stati di attivazione cellulare e per la misurazione delle cascate di segnali. La citometria a flusso offre un modo rapido ed efficace per misurare la segnalazione in un momento specifico nelle singole cellule. I metodi di colorazione per rilevare le molecole di segnalazione e le proteine fosforilate (fosfoflusso) mediante anticorpi possono differire dalla normale colorazione intracellulare e possono essere necessari controlli sperimentali specifici. Per la segnalazione e il fosfoflusso, le cellule devono essere fissate rapidamente per evitare la defosforilazione e potrebbero essere necessari metodi di permeabilizzazione più forti per garantire la permeabilizzazione della membrana nucleare. Come per la colorazione del ciclo cellulare, la fissazione e la permeabilizzazione possono alterare la capacità di misurare le molecole della superficie cellulare. La segnalazione può essere misurata utilizzando coloranti che emettono fluorescenza in risposta ai cambiamenti del calcio. In genere, le cellule vengono caricate con coloranti indicatori di calcio, come indo-1, per determinare un livello di segnalazione di base. Vengono quindi stimolati e il cambiamento nella fluorescenza denota un cambiamento nei livelli di calcio intracellulare.
Rilevamento di piccole particelle
Una varietà crescente di piccole particelle può essere studiata utilizzando la citometria a flusso. Piccole particelle possono includere piastrine, che hanno tipicamente un diametro di 2–3 μm; batteri, che possono variare da 0,3 a 5 μm; extravescicole cellulari, che possono essere ulteriormente suddivise in corpi apoptotici, microvescicole; ed esosomi, il più piccolo dei quali ha un diametro di appena 50 nm. Sebbene non abbiano l'indice di rifrazione degli esosomi, le perline possono essere utilizzate per aiutare a configurare la strumentazione per rilevare piccole particelle (Figura 50). Gli esosomi sono composti principalmente da proteine del citoscheletro, mRNA, microRNA e recettori dell'actina. Sono importanti nella diafonia e nella regolazione delle cellule perché trasferiscono proteine e RNA tra le cellule. Possono essere identificati dalla dispersione in avanti e laterale, ma è necessaria una scala logaritmica per un'adeguata separazione. Il rilevamento di queste particelle può essere problematico perché spesso sono più piccole della lunghezza d'onda della luce utilizzata per rilevarle. La dispersione della luce dipende, tra gli altri fattori, dal diametro delle particelle ed è difficile rilevare particelle più piccole della lunghezza d'onda.
Rilevamento di piccole particelle. Le sfere di calibrazione fluorescenti da 0,2 µm, 0,5 µm e 0,8 µm (Bangs Labs) sono state separate sull'analizzatore cellulare ZE5 utilizzando la dispersione in avanti e FITC come trigger di rilevamento. FITC, isotiocianato di fluoresceina; FSC, dispersione in avanti; SSC, dispersione laterale.
Per studiare piccole particelle, sono stati sviluppati citometri come l'analizzatore cellulare Bio-Rad ZE5 con rivelatori PMT aggiuntivi nella dispersione in avanti di laser a lunghezza d'onda più corta e il trigger per la raccolta dei dati è cambiato da FSC a un segnale fluorescente o più marcatori fluorescenti. Metodi alternativi per il rilevamento avanzato includono l'uso di lunghezze d'onda della luce più brevi, poiché ciò generalmente si traduce in una maggiore dispersione e perline rivestite di anticorpi per aumentare le dimensioni della particella rilevata. Occorre prestare attenzione per ridurre il rumore filtrando il fluido della guaina, in quanto potrebbe mascherare il segnale, e impostando attentamente il livello di soglia, in modo da non escludere gli esosomi. Va notato che man mano che le dimensioni delle particelle diminuiscono, anche la disponibilità dell'antigene diminuisce, portando a una ridotta sensibilità o risoluzione.
Espressione genica e trasfezione
Le proteine fluorescenti sono ampiamente utilizzate nella citometria a flusso per determinare l'espressione genica e l'efficienza di trasfezione in cellule vive e fisse. Sono particolarmente utili quando si eseguono esperimenti di smistamento cellulare. Possono essere reporter di fattori di trascrizione, attività del promotore e pattern di espressione cellulare, nonché screening per l'attività di RNAi e CRISPR, a causa della capacità ad alto rendimento della citometria a flusso. Le proteine fluorescenti possono anche essere fotoattivabili, fotocommutabili e adatte per esperimenti FRET. Inizialmente disponibile solo come proteina fluorescente verde (GFP), ora ci sono oltre un centinaio di proteine fluorescenti che eccitano ed emettono a varie lunghezze d'onda, rendendole perfette per la citometria a flusso multicolore.
Quantificazione assoluta
Sebbene la citometria a flusso possa quantificare l'espressione del marcatore su e nelle cellule, non fornisce informazioni sulla concentrazione cellulare o sulla quantificazione assoluta. Per ovviare a questo, è possibile aggiungere e contare perline fluorescenti. Se al campione viene aggiunta una concentrazione nota di sferette, il numero di sfere raccolte sarà proporzionale al numero di cellule. Alcuni citometri possono fornire conteggi cellulari accurati misurando il volume del campione acquisito e, in questo caso, è possibile misurare il numero di cellule per microlitro.
Interiorizzazione delle particelle
L'interiorizzazione di particelle, marcatori di superficie cellulare e antigeni può avvenire attraverso la fagocitosi. La citometria a flusso si è rivelata un metodo efficace per quantificare la fagocitosi di particelle marcate in modo fluorescente. I coloranti che alterano le loro caratteristiche di fluorescenza quando vengono internalizzati o che estingueranno la fluorescenza legata alla superficie possono essere utilizzati per distinguere tra particelle di superficie e interiorizzate.
Ibridazione in situ fluerescente e rilevamento dell'RNA
L'ibridazione in situ fluorescente (FISH) mediante citometria a flusso è stata dimostrata per la prima volta alla fine degli anni '90 per determinare la lunghezza dei telomeri. Sono state utilizzate sonde fluorescenti di acido nucleico per evidenziare sequenze ripetute specifiche e quindi è stata misurata la fluorescenza utilizzando un software specifico. Da allora sono stati sviluppati protocolli di espressione dell'RNA che consentono la quantificazione dei livelli di mRNA. FISH è uno strumento potente, poiché può essere eseguito in combinazione con la colorazione della superficie per identificare cellule e sottoinsiemi specifici, mentre la PCR quantitativa di trascrizione inversa (RT-qPCR) fornirà informazioni solo su una popolazione cellulare, nonostante sia molto sensibile.
Innovazioni in citometria
La citometria a flusso è diventata più accessibile ai ricercatori attraverso una riduzione della complessità della configurazione dello strumento, una vera automazione, una maggiore sensibilità e un software più intuitivo. Ora è possibile eseguire e analizzare esperimenti di grandi dimensioni senza la necessità di una formazione specializzata. Queste innovazioni includono:
■ Intelligenza artificiale, che ha reso più affidabili l'analisi multiparametrica e l'elaborazione a valle, eliminando le distorsioni ed eliminando gli errori nel gating manuale
■ Strumentazione più piccola e tuttavia più potente con un numero maggiore di laser e filtri
■ Citometria a flusso di imaging, che utilizza una telecamera CCD per acquisire immagini di particelle mentre le cellule passano attraverso il laser. È possibile acquisire più immagini (diverse spettralmente) contemporaneamente, consentendo la creazione di compositi e la determinazione della posizione dell'antigene
■ StarBright Dyes, che sono coloranti fluorescenti di alta qualità con spettri unici che consentono di costruire pannelli più grandi. La citometria di massa (nota anche come citometria a tempo di volo [CyTOF]) è un'altra innovazione nella citometria. La tecnica si basa sull'etichettatura dei campioni con anticorpi legati a isotopi metallici, che possono quindi essere misurati analizzando il tempo impiegato da ciascun isotopo per passare attraverso un campo elettrico verso il rivelatore. La citometria di massa ha la capacità di rilevare segnali in oltre 130 canali, aumentando significativamente la capacità di multiplexing; tuttavia, poiché non tutti i canali possono essere attualmente utilizzati, la dimensione del pannello è limitata a circa 50 marker. La citometria di massa ha subito sostanziali innovazioni recenti, incluso lo sviluppo della citometria di massa per immagini. Utilizzando questa tecnica, le fette di tessuto sottile possono essere colorate e analizzate. Un raggio laser da 1 µm focalizzato sul campione raccoglie gli anticorpi marcati con i metalli e li dirige per il rilevamento utilizzando la tecnologia CyTOF. Utilizzando questo sistema, è possibile rilevare e risolvere contemporaneamente fino a 37 marker. La citometria di massa consente di identificare contemporaneamente più marcatori rispetto alla normale citometria a flusso e la citometria di massa per immagini consente di rilevare più marcatori rispetto alla microscopia. Ma ci sono alcuni aspetti negativi. Più grande è l'isotopo, più tempo impiega a passare attraverso il campo elettrico e l'acquisizione del campione è piuttosto lenta. Inoltre, è necessario un software di analisi specializzato e l'analisi può essere problematica e richiedere molto tempo. La risoluzione di imaging della citometria di massa per immagini è inferiore a quella della microscopia, in modo tale che non è possibile quantificare i dettagli cellulari fini. Una tecnologia simile alla citometria di massa per immagini è la tecnologia MIBI (Multiplexed Ion Beam Imaging). Questo utilizza anche anticorpi etichettati con etichette metalliche monoisotopiche per visualizzare le sezioni di tessuto ma non si abla. Può visualizzare oltre 40 marcatori contemporaneamente ed è in grado di risolvere strutture cellulari fino a 250 nm.
Da:
https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Bio-Rad%20EU_Evergreen%20Flow%20Cytometry_Guide_406213/flow-cytometry-basics-guide.pdf?hsCtaTracking=ae192164-1471-4fb9-9577-ce6d1cadc0e5%7Ccdaea2a5-8e3e-43c3-8d2c-a82844d2313f
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