Nucleic Acid Electrophoresis Review and Troubleshooting Guide / Revisione dell'elettroforesi degli acidi nucleici e guida alla risoluzione dei problemi

Nucleic Acid Electrophoresis Review and Troubleshooting Guide / Revisione dell'elettroforesi degli acidi nucleici e guida alla risoluzione dei problemi

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Nucleic acid electrophoresis is a molecular biology laboratory fundamental, used for preparing samples for downstream molecular applications, determining the results of those applications, and everything in between. The basic principle, taught in introductory courses, is simple: upon application of an electrical current, the negatively charged DNA (or RNA) is pulled through a molecular sieve, causing it to migrate toward the anode. Shorter molecules will move faster, being less retarded by the sieve, resulting in separation based on size/molecular weight.

Yet what is simple in principle may still have some practices not taught in a 101 course that it pays to know. Here we look at some tricks and tips from experts that may improve your electrophoresis experience.

First principles

The vast majority of nucleic acid analysis is run on small gels composed of polysaccharide agarose, with a higher concentration used for separation of lower molecular weight bands. These tend to be run as horizontal (“submarine”) mini-gels. Nucleic acids can also be separated in gels composed of polyacrylamide, which provides “better, higher resolution” of fragments such as smaller PCR products, notes Stephen Fratpietro, Technical Manager of the Paleo-DNA Laboratory at Lakehead University.

Once upon a time, the apparatus itself was a main trouble spot in electrophoresis. But “the rigs now are just so well made that you don’t have equipment problems anymore,” says Andor Kiss, Director, Center for Bioinformatics and Functional Genomics, and Adjunct Assistant Professor at Miami University. They tend not to leak, and the voltages are very even.

Among the biggest mistakes people make are trying to run a gel at too high a voltage or amperage, and ending up partially melting the agarose or getting “that smiley thing,” or they over- or under-load the gel, Kiss explains. He recommends starting with first principles, using the parameters recommended by the equipment manufacturer, or by a guidebook like Molecular Cloning: A Laboratory Manual—commonly known simply as Maniatis, after its original author—and adjusting from there if necessary.

Most people now run their agarose gels in tris borate EDTA buffer (TBE), he says. They used to use tris acetate EDTA (TAE) because the TBE can interfere with downstream applications such as cloning or PCR, but the cleanup and isolation kits are now so good that there is really no carryover of the TBE.

Fratpietro recommends always using fresh reagents, ensuring that the matrix is mixed evenly when making the gel, and checking liquid levels to ensure that the current has a path to travel on.

Ethidium bromide (EtBr) was once the go-to stain to visualize nucleic acid in the gel under UV light. It is still widely used, Kiss points out, but because of fears that it was toxic and mutagenic, many universities generally discourage EtBr’s use in teaching labs and require EtBr-stained gels to be treated as hazardous waste. Thus, a large number of (generally) fluorescent alternatives have been developed and are fairly widely adopted.

Beyond the mini-gel

Polyacrylamide gels—composed of polymerized acrylamide, which is neurotoxic before it is polymerized—provide a more uniform matrix, with smaller pores and greater sensitivity, capable of contending with smaller amounts of sample, than agarose. They are often purchased pre-cast, or they can be pre-made and stored in a moist, cool environment, both allowing “the gel electrophoresis to be run sooner than having to wait to make the gel first,” Fratpietro notes. He suggests making sure the sample/dye mixture falls directly to the bottom of the well to ensure an even run through the matrix.

More demanding contemporary technologies like next-generation sequencing (NGS) may require the resolution afforded by polyacrylamide, says Kiss. But “nowadays it’s probably better to run that analysis on a Bioanalyzer or Fragment Analyzer, which give both high resolution and better quantitation at the same time.”

Preparative electrophoresis

Retrieving and purifying a sample is easier from agarose than from polyacrylamide, Kiss says. Optimizing the sizes of DNA fragments for constructing NGS libraries, for example, is traditionally done by running sheared DNA on a gel and a using a razor blade to cut out a band of the appropriate size.

Researchers would eyeball where that DNA was relative to a size marker ladder. But “the size from your ladder compared to your sample don’t always line up perfectly,” points out Alex Vira, Director of Marketing at Sage Science. The other problem is that you would get a lot of cross-contamination—"DNA would actually migrate across the gel” into adjacent lanes.

Sage designed and markets a series of semi-automated solutions—including Pippin and BluePippin—that allow for isolation and capture of a particular fragment size into a small membrane-bound chamber. “Then you withdraw that from the chamber with a pipette and you're ready to go,” says Kiss. “It’s eliminated all the repetition and the loss of sample, and it has very good sample recovery. It’s pretty much the gold standard.”

Separation (and isolation) of longer fragments, such as those used by the Pacific Bio and Oxford Nanopore sequencing instruments, can benefit from a pulsed field or field inversion electrophoresis, says Vira. Here the current is periodically altered to aid the nucleic acid in snaking its way through the gel matrix.

Troubleshooting

Nucleic acid electrophoresis is generally the next workflow after conventional PCR. So if after running a gel “the gel shows no bands, faint bands, non-specific bands, primer-dimers, or smeared bands,” it might be time to revisit the PCR reaction and its protocol components and reagents, advises Oliver Glenn Hernaez, Global Product Manager, Gene Expression, Life Sciences Group at Bio-Rad Laboratories.

Although electrophoresis has become more foolproof, it always pays to consider some basic troubleshooting tips before they become necessary. For example, Hernaez advises to make sure the anode and cathode are inserted correctly, ensuring that the DNA (or RNA) is flowing from a negative to positive direction. Monitor the run so the DNA doesn’t overshoot the end of the gel. And make sure the gel has been stained so that the nucleic acid is visible (generally) under UV light.

ITALIANO

L'elettroforesi degli acidi nucleici è un fondamentale laboratorio di biologia molecolare, utilizzato per preparare campioni per applicazioni molecolari a valle, determinare i risultati di tali applicazioni e tutto il resto. Il principio di base, insegnato nei corsi introduttivi, è semplice: dopo l'applicazione di una corrente elettrica, il DNA (o RNA) caricato negativamente viene trascinato attraverso un setaccio molecolare, facendolo migrare verso l'anodo. Le molecole più corte si muoveranno più velocemente, essendo meno ritardate dal setaccio, con conseguente separazione in base alle dimensioni/peso molecolare.

Tuttavia, ciò che è semplice in linea di principio può ancora avere alcune pratiche non insegnate in un corso 101 che vale la pena conoscere. Qui esaminiamo alcuni trucchi e suggerimenti di esperti che potrebbero migliorare la tua esperienza di elettroforesi.

Primi principi

La stragrande maggioranza delle analisi degli acidi nucleici viene eseguita su piccoli gel composti da polisaccaride agarosio, con una concentrazione più elevata utilizzata per la separazione delle bande di peso molecolare inferiore. Questi tendono ad essere eseguiti come mini-gel orizzontali ("sottomarini"). Gli acidi nucleici possono anche essere separati in gel composti da poliacrilammide, che fornisce "una risoluzione migliore e più elevata" di frammenti come prodotti di PCR più piccoli, osserva Stephen Fratpietro, Direttore tecnico del Laboratorio Paleo-DNA presso la Lakehead University.

C'era una volta, l'apparato stesso era un problema principale nell'elettroforesi. Ma "gli impianti ora sono così ben fatti che non hai più problemi con le apparecchiature", afferma Andor Kiss, Direttore, Center for Bioinformatics and Functional Genomics e Adjunct Assistant Professor presso la Miami University. Tendono a non perdere e le tensioni sono molto uniformi.

Tra gli errori più grandi che le persone fanno sono provare a far funzionare un gel ad una tensione od ad un amperaggio troppo alti e finire per sciogliere parzialmente l'agarose o ottenere "quella cosa sorridente", oppure sovraccaricare o sottocaricare il gel, spiega Kiss. Raccomanda di iniziare con i primi principi, utilizzando i parametri consigliati dal produttore dell'attrezzatura, o da una guida come Molecular Cloning: A Laboratory Manual (comunemente noto semplicemente come Maniatis, dal suo autore originale) e aggiustando da lì se necessario.

La maggior parte delle persone ora utilizza i propri gel di agarosio in tampone EDTA tris borato (TBE), dice. Usavano il tris acetato EDTA (TAE) perché il TBE può interferire con le applicazioni a valle come la clonazione o la PCR, ma i kit di pulizia e isolamento ora sono così buoni che non c'è davvero alcun riporto del TBE.

Fratpietro consiglia di utilizzare sempre reagenti freschi, assicurandosi che la matrice sia miscelata uniformemente durante la preparazione del gel e controllando i livelli del liquido per assicurarsi che la corrente abbia un percorso da percorrere.

Il bromuro di etidio (EtBr) era una volta il colorante per visualizzare l'acido nucleico nel gel alla luce UV. È ancora ampiamente utilizzato, sottolinea Kiss, ma a causa del timore che fosse tossico e mutageno, molte università generalmente scoraggiano l'uso di EtBr nei laboratori didattici e richiedono che i gel colorati con EtBr siano trattati come rifiuti pericolosi. Pertanto, è stato sviluppato un gran numero di alternative (generalmente) fluorescenti e sono state adottate abbastanza ampiamente.

Oltre il mini-gel

I gel di poliacrilammide, composti da acrilammide polimerizzata, che è neurotossica prima di essere polimerizzata, forniscono una matrice più uniforme, con pori più piccoli ed una maggiore sensibilità, in grado di competere con quantità minori di campione, rispetto all'agarosio. Vengono spesso acquistati prefabbricati, oppure possono essere prefabbricati e conservati in un ambiente umido e fresco, consentendo entrambi "l'esecuzione dell'elettroforesi su gel prima del dover aspettare per fare prima il gel", osserva Fratpietro. Suggerisce di assicurarsi che la miscela di campione/colorante cada direttamente sul fondo del pozzetto per garantire un passaggio uniforme attraverso la matrice.

Tecnologie contemporanee più esigenti come il sequenziamento di nuova generazione (NGS) potrebbero richiedere la risoluzione offerta dal poliacrilammide, afferma Kiss. Ma "oggigiorno è probabilmente meglio eseguire quell'analisi su un bioanalizzatore o analizzatore di frammenti, che forniscono sia un'alta risoluzione che una migliore quantificazione allo stesso tempo".

Elettroforesi preparativa

Il recupero e la purificazione di un campione è più facile dall'agarosio che dal poliacrilammide, afferma Kiss. L'ottimizzazione delle dimensioni dei frammenti di DNA per la costruzione di librerie NGS, ad esempio, viene tradizionalmente eseguita eseguendo il DNA tranciato su un gel ed utilizzando una lama di rasoio per ritagliare una fascia della dimensione appropriata.

I ricercatori vedrebbero il punto in cui quel DNA era relativo ad una scala di marcatori di dimensioni. Ma "le dimensioni della tua scala rispetto al tuo campione non sempre si allineano perfettamente", sottolinea Alex Vira, Direttore del marketing di Sage Science. L'altro problema è che otterresti molta contaminazione incrociata: "il DNA migrerebbe effettivamente attraverso il gel" nelle corsie adiacenti.

Sage ha progettato e commercializza una serie di soluzioni semiautomatiche, tra cui Pippin e BluePippin, che consentono l'isolamento e la cattura di una particolare dimensione del frammento in una piccola camera legata alla membrana. "Poi lo estrai dalla camera con una pipetta e sei pronto per partire", dice Kiss. “Ha eliminato tutte le ripetizioni e la perdita di campione e ha un ottimo recupero del campione. È praticamente il gold standard".

La separazione (e l'isolamento) di frammenti più lunghi, come quelli utilizzati dagli strumenti di sequenziamento Pacific Bio e Oxford Nanopore, possono beneficiare di un campo pulsato o di un'elettroforesi ad inversione di campo, afferma Vira. Qui la corrente viene periodicamente modificata per aiutare l'acido nucleico a farsi strada attraverso la matrice del gel.

Risoluzione dei problemi

L'elettroforesi degli acidi nucleici è generalmente il flusso di lavoro successivo dopo la PCR convenzionale. Quindi, se dopo aver eseguito un gel "il gel non mostra bande, bande deboli, bande non specifiche, dimeri di primer o bande macchiate", potrebbe essere il momento di rivisitare la reazione PCR ed i suoi componenti e reagenti del protocollo, consiglia Oliver Glenn Hernaez , Global Product Manager, Gene Expression, Life Sciences Group presso Bio-Rad Laboratories.

Sebbene l'elettroforesi sia diventata più infallibile, vale sempre la pena considerare alcuni suggerimenti di base per la risoluzione dei problemi prima che diventino necessari. Ad esempio, Hernaez consiglia di assicurarsi che l'anodo ed il catodo siano inseriti correttamente, assicurandosi che il DNA (o RNA) scorra da una direzione negativa a quella positiva. Monitorare la corsa in modo che il DNA non superi l'estremità del gel. E assicurati che il gel sia stato colorato in modo che l'acido nucleico sia visibile (generalmente) alla luce UV.

Da:

https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/589300-Nucleic-Acid-Electrophoresis-Review-and-Troubleshooting-Guide/