Principles of Fluorescence / Principi di fluorescenza
Principles of Fluorescence / Principi di fluorescenza
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Flow cytometry is underpinned by the principles of fluorescence, which are covered in this chapter. We also present useful fluorescent dyes for flow cytometry and explain fluorescence compensation for multicolor panels.
Fluorescent Dyes and Light
Fluorescent dyes are markers used to detect the expression of cellular molecules such as proteins or nucleic acids. They accept light energy (for example, from a laser) at a given wavelength and reemit it at a longer wavelength. These two processes are called excitation and emission. Emission follows excitation extremely rapidly, commonly in nanoseconds, and is known as fluorescence. Before considering the different types of fluorophores available for flow cytometry, it is necessary to understand the principles of light absorbance and emission. Light is a form of electromagnetic energy that travels in waves. These waves have both a frequency and length, which determine the color of the light. The light that can be visualized by the human eye represents a narrow wavelength band (380–700 nm) between UV and IR radiation. Sunlight, for example, contains UV and IR light that, although invisible to the eye, can be felt as warmth on the skin and measured scientifically using photodetectors. The visible spectrum can be further subdivided according to color: red, orange, yellow, green, blue, and violet. Red light has a longer wavelength and lower energy, whereas violet light has a shorter wavelength and higher energy.
Fluorescence
When a fluorophore absorbs light, its electrons become excited and move from a resting state (S0, Figure 1A) to a maximal energy level, called the excited electronic singlet state (S2)
1 . The amount of energy required for this transition will differ for each fluorophore. The duration of the excited state depends on the fluorescent dye and typically lasts for 1–10 ns. The fluorescent dye then undergoes a conformational change, the electrons fall to a lower, more stable energy level called the electronic singlet state (S1 ), and some of the absorbed energy is released as heat
2 . The electrons subsequently fall back to their resting state (S0), releasing the remaining energy (EEmission) as fluorescence 3. The difference between wavelengths of the emission and excitation maxima is called the Stokes shift (Figure 1B). This cycle can repeat several thousand times for a single fluorophore, which allows recycling of fluorophores and thus signal amplification.
Emitted light from a fluorescent dye typically contains less energy than that used to excite it; therefore, the emission wavelength of any fluorescent dye is longer (lower energy) than its excitation wavelength, and thus corresponds to a different color on the electromagnetic spectrum.
The excitation wavelength is critical to the total number of photons of light that the fluorophore will absorb. Fluorescein isothiocyanate (FITC), for example, absorbs light from 400–530 nm but absorbs most efficiently at its peak (or excitation maximum) of 490 nm wavelength. It is desirable to excite fluorophores at their excitation maximum because the greater the number of photons absorbed, the more intense the fluorescence emission will be. The wavelengths of greatest absorption and emission are termed maximal absorbance and maximal emission wavelengths.
Fig. 2. Spectral profiles showing light absorbance and light emission of FITC. A, excellent signal; B, weak signal; ----, 488 nm excitation laser line (blue light). FITC, fluorescein isothiocyanate. / Profili spettrali che mostrano l'assorbimento della luce e l'emissione di luce di FITC. A, ottimo segnale; B, segnale debole; ----, linea laser di eccitazione a 488 nm (luce blu). FITC, isotiocianato di fluoresceina.
A fluorophore’s maximal absorbance indicates the optimal laser line for excitation. In the case of FITC, its maximal absorbance falls within the blue spectrum. Therefore, the blue 488 nm laser, which is close to FITC’s absorbance peak of 490 nm, is commonly used to excite this fluorophore. FITC emits fluorescence from 475 to 650 nm, peaking at 525 nm, which falls in the green spectrum. How the flow cytometer is set up determines how the fluorescent dye is detected. If the filters are used to screen out all light other than that measured at the maximum via channel A (Figure 2), FITC will appear green. Fluorescence color usually refers to the color of light a fluorophore emits at its highest stable excited state. However, if FITC fluorescence is detected in channel B only (Figure 2), it will appear orange and be much weaker in intensity. How the flow cytometer is set up to measure fluorescence will ultimately determine the perceived color of a fluorescent dye. Because the color of the exciting and emitting light is different, they can be separated from one another using optical filters.
Why Use a Fluorescent Marker?
The purpose of a fluorescent marker, such as a fluorophore-conjugated antibody, is to directly target an epitope of interest and allow its biological and biochemical properties to be interrogated. Fluorescent markers are useful in a wide range of applications, including identifying and quantifying distinct cell populations, cell surface receptors, or intracellular targets; cell sorting; immunophenotyping; analyzing calcium flux; determining nucleic acid content; measuring enzyme activity; and studying apoptosis. Several fluorophores can be excited by a single laser. By using filters, it is possible to analyze several parameters of the sample at any one time. This forms the basis of multicolor fluorescence studies.
Which Fluorescent Dyes Are Useful for Flow Cytometry?
A wide range of fluorescent dyes can be used for flow cytometry. The list is ever growing and we will not cover all of them here.
Single and Tandem Dyes
Single dyes like FITC, phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC), and peridinin chlorophyll protein (PerCP) have been available for many years, but there are now alternatives available, including Bio-Rad StarBright Dyes, which offer greater photostability and much brighter fluorescence. In addition, alternative laser lines are becoming more affordable, so dyes excited by 355 nm laser lines are increasing the options for multiplexing. A tandem dye comprises one fluorescent dye covalently coupled to another fluorescent dye. When the first dye (the donor) is excited and reaches its maximal excited electronic singlet state, its energy is transferred to the second dye (the acceptor). This activates the second dye, which then produces the fluorescence emission. The process is called Förster resonance energy transfer (FRET). It is a clever way to achieve a greater Stokes shift and therefore increase the number of colors that can be analyzed from a single laser wavelength. Tandem dyes are very useful for multicolor fluorescence studies, especially in combination with single dyes. For example, Alexa Fluor (A) 488, PE, PerCP-Cyanine (Cy) 5.5, and PE-Texas Red can all be excited at 488 nm, but will produce green, yellow, red, and infrared emissions, respectively, which can then be measured using separate detectors. Fluorescent Proteins Fluorescent proteins, such as green fluorescent protein (GFP), have become integral tools for understanding protein expression in many scientific disciplines. Other fluorescent proteins, like mCherry and yellow fluorescent protein (YFP), have also become widely used for flow cytometry and cell sorting. Fluorescent proteins are often co-expressed or expressed as a fusion with the protein of interest. The benefit of these fluorescent proteins is to allow the quantitation of intracellular markers in live cells, without requiring permeabilization of the cell membrane.
Fluorescence Compensation
One consideration when performing multicolor fluorescence studies is the possibility of spectral overlap between fluorescent dyes. Because the fluorophores used in flow cytometry emit photons of multiple energies and wavelengths, a mathematical method called compensation was developed to address the measurement of the photons of one fluorophore in multiple detectors. Due to the nature of flow cytometry measurements, a particle’s emission is measured not in a single detector, but in all the detectors used in the experiment. For example, two of the most common fluorescent dyes, FITC and PE, maximally emit photons that are green (525 nm) and yellow (578 nm), respectively. But as can be seen in Figure 10, they also emit photons of longer wavelength, all of which can be detected on a multidetector instrument with the corresponding detectors.
In some experiments, multiple fluorescent dyes are used; for example, FITC may be used in combination with PE. In these cases, the relative contribution of each fluorescent dye to the signal in a given detector must be determined. In Figure 2, you can see that there is some FITC signal in the neighboring PE channel (593/52 filter), the PerCP/PerCPCy5.5 channel (692/80 filter), and even the PE-Cy7 channel (750LP filter), all of which will need to be removed. As more fluorescent dyes are added, the signal from each additional dye must be taken into account. In Figure 2, you can see how PE, when excited by the 488 nm laser, also emits in the PerCP/PerCP-Cy5.5 channel (692/80 channel), and the PE-Cy7 channel (750LP filter), and again would need to be removed. In a multiplexing experiment, if PerCP-Cy5.5 was added, which is another 488 nm excitable dye detected in the 692/80 channel, both FITC and PE signal would have to be subtracted from this channel. You can see how compensation can be applied to a sample stained with antibodies conjugated to the StarBright Violet 710 or StarBright Violet 790 Dyes. Single stained samples reveal the amount of spectral overlap. When the sample is stained with both fluorescent dyes, without compensation, a double positive population is observed. However, when the correct level of compensation is applied using specific software, the true level of staining is revealed. The software calculates spillover values and applies this to the data to obtain correctly compensated data. After compensation, no double positive cells are observed, which is to be expected from these mutually exclusive markers. You can avoid the need for compensation by using fluorophores that do not have overlapping emission spectra. Alternatively, you can combine fluorescent dyes that can be activated only by different laser lines (providing the lasers are spatially separated), but as you increase the number of fluorescent dyes this becomes practically impossible. We have created common human immunophenotyping panels, using four fluorescent dyes, which require no compensation. They are useful to identify common populations or as a start, to build larger and more complex panels.
ITALIANO
La citometria a flusso è supportata dai principi della fluorescenza, che sono trattati in questo capitolo. Presentiamo anche utili coloranti fluorescenti per la citometria a flusso e spieghiamo la compensazione della fluorescenza per i pannelli multicolori.
Coloranti fluorescenti e luce
I coloranti fluorescenti sono marcatori utilizzati per rilevare l'espressione di molecole cellulari come proteine o acidi nucleici. Accettano l'energia luminosa (ad esempio, da un laser) a una determinata lunghezza d'onda e la riemettono ad una lunghezza d'onda maggiore. Questi due processi sono chiamati eccitazione ed emissione. L'emissione segue l'eccitazione in modo estremamente rapido, comunemente in nanosecondi, ed è nota come fluorescenza. Prima di considerare i diversi tipi di fluorofori disponibili per la citometria a flusso, è necessario comprendere i principi di assorbimento ed emissione della luce. La luce è una forma di energia elettromagnetica che viaggia in onde. Queste onde hanno sia una frequenza che una lunghezza, che determinano il colore della luce. La luce che può essere visualizzata dall'occhio umano rappresenta una banda di lunghezza d'onda stretta (380–700 nm) tra la radiazione UV e IR. La luce solare, ad esempio, contiene luce UV e IR che, sebbene invisibile agli occhi, può essere percepita come calore sulla pelle e misurata scientificamente utilizzando fotorilevatori. Lo spettro visibile può essere ulteriormente suddiviso in base al colore: rosso, arancione, giallo, verde, blu e viola. La luce rossa ha una lunghezza d'onda più lunga e un'energia inferiore, mentre la luce viola ha una lunghezza d'onda più corta e un'energia più elevata.
Fluorescenza
Quando un fluoroforo assorbe la luce, i suoi elettroni si eccitano e si spostano da uno stato di riposo (S0, Figura 1A) a un livello di energia massimo, chiamato stato di singoletto elettronico eccitato (S2)
1. La quantità di energia richiesta per questa transizione sarà diversa per ciascun fluoroforo. La durata dello stato eccitato dipende dal colorante fluorescente e in genere dura da 1 a 10 ns. Il colorante fluorescente subisce quindi un cambiamento conformazionale, gli elettroni cadono a un livello di energia più basso e più stabile chiamato stato di singoletto elettronico (S1) e parte dell'energia assorbita viene rilasciata sotto forma di calore
2. Gli elettroni ricadono successivamente nel loro stato di riposo (S0), rilasciando l'energia rimanente (emissione EE) sotto forma di fluorescenza 3 . La differenza tra le lunghezze d'onda dei massimi di emissione e di eccitazione è chiamata spostamento di Stokes (Figura 1B). Questo ciclo può ripetersi diverse migliaia di volte per un singolo fluoroforo, che consente il riciclaggio dei fluorofori e quindi l'amplificazione del segnale.
La luce emessa da un colorante fluorescente contiene tipicamente meno energia di quella utilizzata per eccitarlo; pertanto, la lunghezza d'onda di emissione di qualsiasi colorante fluorescente è più lunga (energia inferiore) della sua lunghezza d'onda di eccitazione e quindi corrisponde a un colore diverso sullo spettro elettromagnetico.
La lunghezza d'onda di eccitazione è fondamentale per il numero totale di fotoni di luce che il fluoroforo assorbirà. L'isotiocianato di fluoresceina (FITC), ad esempio, assorbe la luce da 400 a 530 nm ma assorbe in modo più efficiente al suo picco (o massimo di eccitazione) di lunghezza d'onda di 490 nm. È desiderabile eccitare i fluorofori alla loro massima eccitazione perché maggiore è il numero di fotoni assorbiti, più intensa sarà l'emissione di fluorescenza. Le lunghezze d'onda di maggiore assorbimento ed emissione sono denominate assorbanza massima e lunghezze d'onda di emissione massima.
La massima assorbanza di un fluoroforo indica la linea laser ottimale per l'eccitazione. Nel caso di FITC, la sua massima assorbanza rientra nello spettro blu. Pertanto, il laser blu a 488 nm, che è vicino al picco di assorbimento di FITC di 490 nm, è comunemente usato per eccitare questo fluoroforo. FITC emette fluorescenza da 475 a 650 nm, con un picco a 525 nm, che rientra nello spettro verde. Il modo in cui è impostato il citometro a flusso determina come viene rilevato il colorante fluorescente. Se i filtri vengono utilizzati per schermare tutta la luce diversa da quella misurata al massimo tramite il canale A (Figura 2), FITC apparirà in verde. Il colore della fluorescenza di solito si riferisce al colore della luce che un fluoroforo emette nel suo stato eccitato più stabile. Tuttavia, se la fluorescenza FITC viene rilevata solo nel canale B (Figura 2), apparirà arancione e avrà un'intensità molto più debole. Il modo in cui il citometro a flusso è impostato per misurare la fluorescenza determinerà in definitiva il colore percepito di un colorante fluorescente. Poiché il colore della luce eccitante ed emittente è diverso, possono essere separati l'uno dall'altro utilizzando filtri ottici.
Perché usare un pennarello fluorescente?
Lo scopo di un marcatore fluorescente, come un anticorpo coniugato con fluoroforo, è quello di mirare direttamente ad un epitopo di interesse e consentire l'interrogatorio delle sue proprietà biologiche e biochimiche. I marcatori fluorescenti sono utili in un'ampia gamma di applicazioni, inclusa l'identificazione e la quantificazione di popolazioni cellulari distinte, recettori di superficie cellulare o bersagli intracellulari; smistamento delle cellule; immunofenotipizzazione; analizzare il flusso di calcio; determinazione del contenuto di acido nucleico; misurare l'attività enzimatica; e studiare l'apoptosi. Diversi fluorofori possono essere eccitati da un singolo laser. Utilizzando i filtri, è possibile analizzare più parametri del campione contemporaneamente. Ciò costituisce la base degli studi di fluorescenza multicolore.
Quali coloranti fluorescenti sono utili per la citometria a flusso?
Un'ampia gamma di coloranti fluorescenti può essere utilizzata per la citometria a flusso. L'elenco è in continua crescita e non li tratteremo tutti qui. Coloranti singoli e tandem
Coloranti singoli come FITC, ficoeritrina (PE), alloficocianina (APC) e peridinina clorofilla proteina (PerCP) sono disponibili da molti anni, ma ora sono disponibili alternative, tra cui Bio-Rad StarBright Dyes, che offrono maggiori fotostabilità e fluorescenza molto più brillante.
Inoltre, le linee laser alternative stanno diventando più convenienti, quindi i coloranti eccitati dalle linee laser a 355 nm stanno aumentando le opzioni per il multiplexing. Un colorante tandem comprende un colorante fluorescente accoppiato covalentemente ad un altro colorante fluorescente. Quando il primo colorante (il donatore) viene eccitato e raggiunge il suo stato di singoletto elettronico eccitato massimo, la sua energia viene trasferita al secondo colorante (l'accettore). Questo attiva il secondo colorante, che poi produce l'emissione di fluorescenza. Il processo è chiamato Förster Resonance Energy Transfer (FRET). È un modo intelligente per ottenere uno spostamento Stokes maggiore e quindi aumentare il numero di colori che possono essere analizzati da una singola lunghezza d'onda del laser. I coloranti tandem sono molto utili per studi di fluorescenza multicolore, specialmente in combinazione con coloranti singoli. Ad esempio, Alexa Fluor (A) 488, PE, PerCP-Cyanine (Cy) 5.5 e PE-Texas Red possono essere tutti eccitati a 488 nm, ma producono rispettivamente emissioni verdi, gialle, rosse e infrarosse, che possono quindi essere misurate utilizzando rivelatori separati.
Proteine fluorescenti
Le proteine fluorescenti, come la proteina fluorescente verde (GFP), sono diventate strumenti integrali per comprendere l'espressione proteica in molte discipline scientifiche. Anche altre proteine fluorescenti, come mCherry e la proteina fluorescente gialla (YFP), sono diventate ampiamente utilizzate per la citometria a flusso e lo smistamento cellulare. Le proteine fluorescenti sono spesso co-espresse o espresse come fusione con la proteina di interesse. Il vantaggio di queste proteine fluorescenti è quello di consentire la quantificazione dei marcatori intracellulari nelle cellule vive, senza richiedere la permeabilizzazione della membrana cellulare.
Compensazione della fluorescenza
Una considerazione quando si eseguono studi di fluorescenza multicolore è la possibilità di sovrapposizione spettrale tra i coloranti fluorescenti. Poiché i fluorofori utilizzati nella citometria a flusso emettono fotoni di energie e lunghezze d'onda multiple, è stato sviluppato un metodo matematico chiamato compensazione per affrontare la misurazione dei fotoni di un fluoroforo in più rivelatori. A causa della natura delle misurazioni della citometria a flusso, l'emissione di una particella non viene misurata in un singolo rivelatore, ma in tutti i rivelatori utilizzati nell'esperimento. Ad esempio, due dei coloranti fluorescenti più comuni, FITC e PE, emettono al massimo fotoni rispettivamente verdi (525 nm) e gialli (578 nm). Ma come si può vedere nella Figura 2, emettono anche fotoni di lunghezza d'onda maggiore, che possono essere tutti rilevati su uno strumento multirilevatore con i rivelatori corrispondenti.
In alcuni esperimenti vengono utilizzati più coloranti fluorescenti; ad esempio, FITC può essere utilizzato in combinazione con PE. In questi casi, deve essere determinato il contributo relativo di ciascun colorante fluorescente al segnale in un determinato rivelatore. Nella Figura 2, puoi vedere che c'è del segnale FITC nel canale PE adiacente (filtro 593/52), nel canale PerCP/PerCPCy5.5 (filtro 692/80) e persino nel canale PE-Cy7 (filtro 750LP) , che dovranno essere tutti rimossi. Man mano che vengono aggiunti più coloranti fluorescenti, è necessario prendere in considerazione il segnale di ciascun colorante aggiuntivo. Nella Figura 2, puoi vedere come il PE, quando eccitato dal laser a 488 nm, emette anche nel canale PerCP/PerCP-Cy5.5 (canale 692/80) e nel canale PE-Cy7 (filtro 750LP) ed ancora andrebbe rimosso. In un esperimento di multiplexing, se fosse stato aggiunto PerCP-Cy5.5, che è un altro colorante eccitabile a 488 nm rilevato nel canale 692/80, sia il segnale FITC che quello PE dovrebbero essere sottratti da questo canale. E' possibile vedere come la compensazione può essere applicata a un campione colorato con anticorpi coniugati con i coloranti StarBright Violet 710 o StarBright Violet 790. I singoli campioni colorati rivelano la quantità di sovrapposizione spettrale. Quando il campione viene colorato con entrambi i coloranti fluorescenti, senza compensazione, si osserva una popolazione doppia positiva. Tuttavia, quando viene applicato il corretto livello di compensazione utilizzando un software specifico, viene rivelato il vero livello di colorazione. Il software calcola i valori di spillover e li applica ai dati per ottenere dati correttamente compensati. Dopo la compensazione, non si osservano cellule doppie positive, il che è prevedibile da questi marcatori che si escludono a vicenda. È possibile evitare la necessità di compensazione utilizzando fluorofori che non hanno spettri di emissione sovrapposti. In alternativa, puoi combinare coloranti fluorescenti che possono essere attivati solo da diverse linee laser (a condizione che i laser siano spazialmente separati), ma aumentando il numero di coloranti fluorescenti questo diventa praticamente impossibile. Abbiamo creato comuni pannelli di immunofenotipizzazione umana, utilizzando quattro coloranti fluorescenti, che non richiedono compensazione. Sono utili per identificare popolazioni comuni o come punto di partenza, per costruire pannelli più grandi e complessi.
Da:
https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Bio-Rad%20EU_Evergreen%20Flow%20Cytometry_Guide_406213/flow-cytometry-basics-guide.pdf?hsCtaTracking=ae192164-1471-4fb9-9577-ce6d1cadc0e5%7Ccdaea2a5-8e3e-43c3-8d2c-a82844d2313f
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