PASTE Espande CRISPR Toolbox inserendo grandi pezzi di DNA / PASTE Expands CRISPR Toolbox by Inserting Large Pieces of DNA
PASTE Espande CRISPR Toolbox inserendo grandi pezzi di DNA / PASTE Expands CRISPR Toolbox by Inserting Large Pieces of DNA
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Basandosi sul sistema di editing genetico CRISPR,
CRISPR-Cas9 ha modificato il genoma umano negli ultimi dieci anni. Sebbene i tipi di modifiche siano variati, una sfida irrisolta è stata l'integrazione di grandi pezzi di DNA senza rotture del DNA a doppio filamento. Ora, un gruppo del MIT descrive un nuovo strumento chiamato PASTE (aggiunta programmabile tramite elementi di targeting specifici del sito) che ha fornito geni fino a 36.000 paia di basi di DNA a diversi tipi di cellule umane (così come alle cellule del fegato nei topi). PASTE utilizza una nickasi CRISPR-Cas9 fusa a due enzimi, una trascrittasi inversa ed una serina integrasi, per il reclutamento genomico mirato e l'integrazione del DNA.
La ricerca è stata pubblicata su Nature Biotechnology , nel documento “ Inserimento del genoma con trascinamento della selezione di grandi sequenze senza scissione del DNA a doppio filamento utilizzando integrasi dirette da CRISPR. "
"È un nuovo modo genetico di mirare potenzialmente a queste malattie davvero difficili da curare", ha affermato Omar Abudayyeh, PhD, un ricercatore McGovern presso il McGovern Institute for Brain Research del MIT. "Volevamo lavorare su ciò che la terapia genica avrebbe dovuto fare al suo inizio originale, ovvero sostituire i geni, non solo correggere le singole mutazioni".
Per questo studio, i ricercatori si sono concentrati sulle serina integrasi, che possono inserire enormi pezzi di DNA, grandi fino a 50.000 paia di basi. Questi enzimi prendono di mira specifiche sequenze del genoma note come siti di attacco. Quando trovano il sito nel genoma dell'ospite, si legano ad esso e integrano il loro carico utile di DNA.
"Proprio come CRISPR, queste integrasi provengono dalla battaglia in corso tra batteri e virus che li infettano", ha affermato Jonathan Gootenberg, PhD, anche lui McGovern Fellow. "Parla di come possiamo continuare a trovare un'abbondanza di nuovi strumenti interessanti ed utili da questi sistemi naturali".
In lavori precedenti, gli scienziati hanno trovato difficile sviluppare questi enzimi per la terapia umana perché i siti di attacco sono molto specifici ed è difficile riprogrammare le integrasi per mirare ad altri siti. Il gruppo del MIT si è reso conto che la combinazione di questi enzimi con un sistema CRISPR-Cas9 che inserisce il sito corretto avrebbe consentito una facile riprogrammazione del potente sistema di inserimento.
PASTE include un enzima Cas9 che taglia in un sito genomico specifico, guidato da un filamento di RNA che si lega a quel sito. Ciò consente loro di indirizzare qualsiasi sito nel genoma per l'inserimento del sito di attacco, che contiene 46 paia di basi del DNA. Questo inserimento può essere effettuato senza introdurre rotture a doppio filamento aggiungendo prima un filamento di DNA tramite una trascrittasi inversa fusa, quindi il suo filamento complementare.
Una volta che il sito è incorporato, l'integrasi può arrivare ed inserire il suo carico utile di DNA molto più grande nel genoma in quel sito.
"Pensiamo che questo sia un grande passo verso il raggiungimento del sogno dell'inserimento programmabile del DNA", ha detto Gootenberg. "È una tecnica che può essere facilmente adattata sia al sito che vogliamo integrare sia al carico".
In questo studio, i ricercatori hanno dimostrato di poter utilizzare PASTE per inserire geni in diversi tipi di cellule umane, tra cui cellule epatiche, cellule T e linfoblasti. Hanno testato il sistema di consegna con 13 diversi geni del carico utile, inclusi alcuni che potrebbero essere terapeuticamente utili, e sono stati in grado di inserirli in nove diverse posizioni nel genoma.
In queste cellule, i ricercatori sono stati in grado di inserire geni con una percentuale di successo compresa tra il 5 e il 60%. Questo approccio ha prodotto anche pochissimi "indel" indesiderati nei siti di integrazione genica.
Più specificamente, gli autori hanno notato che PASTE ha efficienze di modifica "simili o superiori a quelle della riparazione diretta dall'omologia e dei metodi basati sull'unione di estremità non omologhe, con attività nelle cellule non in divisione e in vivo con un minor numero di eventi fuori bersaglio rilevabili".
"Vediamo pochissimi indel, e poiché non stiamo facendo rotture a doppio filamento, non devi preoccuparti di riarrangiamenti cromosomici o delezioni del braccio cromosomico su larga scala", ha detto Abudayyeh.
I ricercatori hanno anche dimostrato di poter inserire geni nei fegati "umanizzati" dei topi. I fegati di questi topi sono costituiti per circa il 70% da epatociti umani e PASTE ha integrato con successo nuovi geni in circa il 2,5% di queste cellule.
Le sequenze di DNA che i ricercatori hanno inserito in questo studio erano lunghe fino a 36.000 paia di basi, ma ritengono che potrebbero essere utilizzate anche sequenze ancora più lunghe. Un gene umano può variare da poche centinaia a più di due milioni di paia di basi, anche se per scopi terapeutici è necessario utilizzare solo la sequenza codificante della proteina, riducendo drasticamente la dimensione del segmento di DNA che deve essere inserito nel genoma.
I ricercatori stanno ora esplorando ulteriormente la possibilità di utilizzare questo strumento come un possibile modo per sostituire il gene difettoso della fibrosi cistica. Questa tecnica potrebbe anche essere utile per il trattamento di malattie del sangue causate da geni difettosi, come l'emofilia ed il deficit di G6PD, o la malattia di Huntington, un disturbo neurologico causato da un gene difettoso che ha troppe ripetizioni geniche.
"Una delle cose fantastiche dell'ingegneria di queste tecnologie molecolari è che le persone possono basarsi su di esse, svilupparle e applicarle in modi che forse non avevamo pensato o non avevamo considerato", ha detto Gootenberg. "È davvero fantastico far parte di quella comunità emergente".
ENGLISH
CRISPR-Cas9 has been editing the human genome for the past decade. Although the types of edits have varied, an unsolved challenge has been the integration of large pieces of DNA without double-stranded DNA breaks. Now, a team from MIT describes a new tool called PASTE (programmable addition via site-specific targeting elements) which delivered genes as long as 36,000 DNA base pairs to several types of human cells (as well as to liver cells in mice). PASTE uses a CRISPR–Cas9 nickase fused to two enzymes—a reverse transcriptase and a serine integrase—for targeted genomic recruitment and integration of DNA.
The research is published in Nature Biotechnology, in the paper, “Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases.”
“It’s a new genetic way of potentially targeting these really hard to treat diseases,” said Omar Abudayyeh, PhD, a McGovern fellow at MIT’s McGovern Institute for Brain Research. “We wanted to work toward what gene therapy was supposed to do at its original inception, which is to replace genes, not just correct individual mutations.”
For this study, the researchers focused on serine integrases, which can insert huge chunks of DNA, as large as 50,000 base pairs. These enzymes target specific genome sequences known as attachment sites. When they find the site in the host genome, they bind to it and integrate their DNA payload.
“Just like CRISPR, these integrases come from the ongoing battle between bacteria and the viruses that infect them,” said Jonathan Gootenberg, PhD, also a McGovern Fellow. “It speaks to how we can keep finding an abundance of interesting and useful new tools from these natural systems.”
In past work, scientists have found it challenging to develop these enzymes for human therapy because the attachment sites are very specific, and it’s difficult to reprogram integrases to target other sites. The MIT team realized that combining these enzymes with a CRISPR-Cas9 system that inserts the correct site would enable easy reprogramming of the powerful insertion system.
PASTE includes a Cas9 enzyme that cuts at a specific genomic site, guided by a strand of RNA that binds to that site. This allows them to target any site in the genome for insertion of the attachment site, which contains 46 DNA base pairs. This insertion can be done without introducing any double-stranded breaks by adding one DNA strand first via a fused reverse transcriptase, then its complementary strand.
Once the site is incorporated, the integrase can come along and insert its much larger DNA payload into the genome at that site.
“We think that this is a large step toward achieving the dream of programmable insertion of DNA,” Gootenberg said. “It’s a technique that can be easily tailored both to the site that we want to integrate as well as the cargo.”
In this study, the researchers showed that they could use PASTE to insert genes into several types of human cells, including liver cells, T cells, and lymphoblasts. They tested the delivery system with 13 different payload genes, including some that could be therapeutically useful, and were able to insert them into nine different locations in the genome.
In these cells, the researchers were able to insert genes with a success rate ranging from 5–60%. This approach also yielded very few unwanted “indels” at the sites of gene integration.
More specifically, the authors noted that PASTE has editing efficiencies “similar to or exceeding those of homology-directed repair and non-homologous end joining-based methods, with activity in nondividing cells and in vivo with fewer detectable off-target events.”
“We see very few indels, and because we’re not making double-stranded breaks, you don’t have to worry about chromosomal rearrangements or large-scale chromosome arm deletions,” Abudayyeh said.
The researchers also demonstrated that they could insert genes in “humanized” livers in mice. Livers in these mice consist of about 70% human hepatocytes, and PASTE successfully integrated new genes into about 2.5% of these cells.
The DNA sequences that the researchers inserted in this study were up to 36,000 base pairs long, but they believe even longer sequences could also be used. A human gene can range from a few hundred to more than two million base pairs, although for therapeutic purposes only the coding sequence of the protein needs to be used, drastically reducing the size of the DNA segment that needs to be inserted into the genome.
The researchers are now further exploring the possibility of using this tool as a possible way to replace the defective cystic fibrosis gene. This technique could also be useful for treating blood diseases caused by faulty genes, such as hemophilia and G6PD deficiency, or Huntington’s disease, a neurological disorder caused by a defective gene that has too many gene repeats.
“One of the fantastic things about engineering these molecular technologies is that people can build on them, develop and apply them in ways that maybe we didn’t think of or hadn’t considered,” Gootenberg said. “It’s really great to be part of that emerging community.”
Da:
https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/paste-expands-crispr-toolbox-by-inserting-large-pieces-of-dna/?fbclid=IwAR2ThOaz7MqYV7BpQBziO9CwSawwT_bncq7QQWukhkgJIzAM85DdFT5zDq0
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