Gene modification for cell therapy applications / Modifica genica per applicazioni di terapia cellulare

 Gene modification for cell therapy applications / Modifica genica per applicazioni di terapia cellulare

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 4.  Cytotoxicity assay workflow / Flusso di lavoro del test di citotossicità

Achieving efficiency with CTS TrueCut Cas9 Protein and the CTS Xenon System

Introduction

 The advanced therapeutics industry has been undergoing intense change, with the clinical success of CAR T cell therapy spurring increased interest and investments. A critical component of any therapeutic developer’s risk mitigation strategy is to ensure that the manufacturing workflow incorporates equipment and reagents suitable for clinical manufacturing. Thermo Fisher Scientific is focused on providing manufacturing solutions that are appropriate for long-term commercialization of therapeutic products, through the addition of new innovative technologies to the Gibco™ Cell Therapy Systems™ (CTS™) product suite. Here we showcase how a large-volume electroporation system, the Gibco™ CTS™ Xenon™ Electroporation System, can be used with the Gibco™ CTS™ TrueCut™ Cas9 Protein to provide a streamlined path to clinical cell therapy manufacturing.

Materials and methods

Overview 

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were previously isolated from an apheresis product using the Gibco™ CTS™ Rotea™ Counterflow Centrifugation System and frozen for future use. On day 0, PBMCs were thawed and activated using Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28 beads. The T cells were then expanded in Gibco™ CTS™ OpTmizer™ T Cell Expansion Serum-Free Medium (SFM) supplemented with Gibco™ CTS™ Immune Cell Serum Replacement (SR) and other components as instructed per the product insert. On day 3, activated T cells were debeaded and electroporated using either the Invitrogen™ Neon™ Transfection System or the CTS Xenon Electroporation System in conjunction with CTS TrueCut Cas9 Protein and Invitrogen™ TrueGuide™ Synthetic gRNA (sgRNA). The T cells were divided into two populations per electroporation condition for downstream analysis, then put back into culture for expansion in complete CTS OpTmizer medium. On days 6 and 10, cells were analyzed for expansion, viability, and phenotype as well as knock-in and knockout efficiency, using the Invitrogen™ Attune™ NxT Flow Cytometer. Cells were frozen (cryopreserved) on day 9, then later thawed, to simulate clinical practice before testing functionality in a CAR T killing assay on day 12. Imaging was conducted on the Invitrogen™ EVOS™ M5000 Imaging System. Figure 1. Autologous T cell therapy workflow. 

Experimental details Cells PBMCs isolated from fresh leukapheresis products from 3 healthy human donors Cell concentration during electroporation 5 x 107 cells/mL Payload CTS TrueCut Cas9 Protein 120 µg/mL Custom TRAC sgRNA 30 µg/mL Linear CAR donor dsDNA 240 µg/mL

 Electroporation experimental setup

To demonstrate electroporation efficiency across different scales, we tested 100 µL of cell suspension on the Neon system and 1 mL of cell suspension on the CTS Xenon system using the Gibco™ CTS™ Xenon™ SingleShot Electroporation Chamber across three different donors (donors A, B, and C). In addition, donor C was used for scale-up to an 18 mL electroporation volume on the CTS Xenon system using the Gibco™ Xenon™ Electroporation Cartridge, MultiShot™ format, 5–25 mL. Cell density was 5 x 107 cells/mL in Gibco™ CTS™ Xenon™ Genome Editing Buffer across all donors and scale conditions. A “no electroporation” control was also tested. To demonstrate a genetic modification strategy that is clinically relevant, we used the CTS Xenon electroporation system to deliver CTS TrueCut Cas9 Protein and TRAC-encoded TrueGuide sgRNA along with a donor dsDNA chimeric antigen receptor (CAR) construct to the cells. 

Flow cytometry gating strategy 

The Attune NxT Flow Cytometer was used to assess gene editing efficiency and phenotype. Figure 3 shows the gating strategies that were applied: A represents the parental gate, B represents the unedited population, and C represents the edited cell population. The V5 antibody was used to detect a part of the CAR antigen on the T cells to quantify how many cells expressed the CAR on their membrane.

CAR T killing assay 

CAR T cells from donors A and B were tested for functionality in a cytotoxicity assay (Figure 4). Briefly, cells were frozen (cryopreserved) on day 9, then later thawed and grown for 3 days post-thaw to simulate clinical practice. Effector CAR T cells or control cells (unmodified cytotoxic T lymphocytes (CTLs)) were thawed and seeded into 96-well plates containing Green Fluorescent Protein (GFP)-labeled Nalm6 target cells at effector to target (E:T) ratios ranging from 10:1 to 0:1. The E:T cell mixtures were incubated for 6 hours and analyzed for percent cytotoxicity using the EVOS M5000 Imaging System and the Attune NxT Flow Cytometer.

Results 

Viability and cell expansion

 Electroporation success is a balance between transfection efficiency and viability, and post-electroporation viability greater than 70% is generally considered to be acceptable. Viability was assessed at 72 hours post-electroporation and was consistent across various electroporation volume scales, including the no-electroporation controls. This consistency demonstrated that electroporation itself, as well as the electroporation volume, did not significantly alter cell viability (Figure 5). In addition, viability following electroporation by the CTS Xenon system was well above 70% for all donors.  We show a no-electroporation control (0 µL), electroporation of 100 µL using the Neon system, and electroporation of 1 mL using a CTS Xenon™ SingleShot Electroporation Chamber in the CTS Xenon system, for all donors.  Cell viability measured on day 6, 3 days post-electroporation with the CTS Xenon system. Figure 6. Cell expansion and viability were tested on the day of electroporation (day 3) as well as 3 and 7 days post-electroporation (days 6 and 10, respectively). Cell numbers were recorded immediately prior to electroporation (day 3), and cell growth was assessed at 3 and 7 days post-electroporation (days 6 and 10, respectively), to ensure modified cells were capable of expansion. The electroporation-only control cells and the modified cells that received payload were able to expand 25- to 35-fold over the course of 7 days (Figure 6). As expected, modified cells exhibited slightly lower expansion due to internalization of the payload and the physical effects of electroporation. Cell viability on day 10 was roughly 90% for all donors and electroporation conditions.

Transfection efficiency 

Activated T cells were genetically modified with either the Neon (100 µL) or CTS Xenon (1 mL) transfection systems. The cells were modified with ribonucleoprotein complexes comprising CTS TrueCut Cas9 Protein and TrueGuide sgRNA encoding the TRAC site.  The CTS Xenon system can be used to easily scale and optimize the transfection process in a closed system.

Phenotype 

T cell phenotype was assessed on the Attune NxT Flow Cytometer.

 Compared to no-electroporation controls, there is minimal or no phenotypic change across the electroporation volumes tested. There was a shift in phenotype when comparing cells before and after activation, electroporation, and expansion, but no significant impact from electroporation alone  Phenotypic data post-electroporation.  CAR T cells were tested for cytotoxic functionality on day 12 post-electroporation. 

Cytotoxicity

 Cytotoxicity was assessed using a CAR T cell killing assay. After thaw, CAR T cells exhibited sustained expression of the CAR construct and demonstrated the ability to efficiently kill GFP-labeled target cells.

Conclusions

 Cell therapy manufacturing guidelines have been evolving as regulatory agencies implement more stringent requirements in an effort to standardize these therapeutics. Ensuring suitability of instruments and reagents for cell therapy manufacturing is a core foundation of our Gibco™ CTS™ product design. As demonstrated through electroporation efficiency and functionality of the resulting CAR T cells, the CTS Xenon system has been designed to scale up and meet requirements for commercial manufacturing processes. The system can be integrated with reagents such as CTS TrueCut Cas9 Protein as well as a range of products and tools designed for use in cell therapy manufacturing to close and optimize the cell engineering step of your manufacturing process. Upon customer request, Thermo Fisher can supply regulatory support files for instruments and consumables to assist in regulatory filings. It is the responsibility of the end user to ensure regulatory compliance.

ITALIANO

Raggiungere l'efficienza con CTS TrueCut Cas9 Protein e CTS Xenon System

Introduzione

 L'industria delle terapie avanzate sta subendo un intenso cambiamento, con il successo clinico della terapia con cellule T CAR che ha stimolato un aumento dell'interesse e degli investimenti. Una componente fondamentale della strategia di mitigazione del rischio di qualsiasi sviluppatore terapeutico è garantire che il flusso di lavoro di produzione incorpori attrezzature e reagenti adatti alla produzione clinica. Thermo Fisher Scientific si concentra sulla fornitura di soluzioni di produzione appropriate per la commercializzazione a lungo termine di prodotti terapeutici, attraverso l'aggiunta di nuove tecnologie innovative alla suite di prodotti Gibco™ Cell Therapy Systems™ (CTS™). Qui mostriamo come un sistema di elettroporazione per grandi volumi, il sistema di elettroporazione Gibco™ CTS™ Xenon™, può essere utilizzato con la proteina Gibco™ CTS™ TrueCut™ Cas9 per fornire un percorso semplificato alla produzione di terapia cellulare clinica.

 Materiali e metodi

 Panoramica

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state precedentemente isolate da un prodotto di aferesi utilizzando il sistema di centrifugazione controcorrente Gibco™ CTS™ Rotea™ e congelate per un utilizzo futuro. Il giorno 0, le PBMC sono state scongelate ed attivate utilizzando sfere Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28. Le cellule T sono state quindi espanse in Gibco™ CTS™ OpTmizer™ T Cell Expansion Serum-Free Medium (SFM) integrato con Gibco™ CTS™ Immune Cell Serum Replacement (SR) e altri componenti come indicato nell'inserto del prodotto. Il giorno 3, le cellule T attivate sono state prive di perline ed elettroporate utilizzando il sistema di trasfezione Invitrogen™ Neon™ o il sistema di elettroporazione Xenon CTS in combinazione con la proteina CTS TrueCut Cas9 e il gRNA sintetico (sgRNA) Invitrogen™ TrueGuide™. Le cellule T sono state divise in due popolazioni per condizione di elettroporazione per l'analisi a valle, quindi rimesse in coltura per l'espansione nel mezzo CTS OpTmizer completo. Nei giorni 6 e 10, le cellule sono state analizzate per l'espansione, la vitalità ed il fenotipo, nonché l'efficienza knock-in e knockout, utilizzando il citometro a flusso Invitrogen™ Attune™ NxT. Le cellule sono state congelate (crioconservate) il giorno 9, quindi successivamente scongelate, per simulare la pratica clinica prima di testare la funzionalità in un test di uccisione CAR T il giorno 12. L'imaging è stato condotto sul sistema di imaging Invitrogen™ EVOS™ M5000. 

Dettagli sperimentali 

Cellule PBMC isolate da prodotti freschi di leucaferesi da 3 donatori umani sani Concentrazione cellulare durante l'elettroporazione 5 x 107 cellule/mL Payload CTS TrueCut Cas9 Protein 120 µg/mL TRAC personalizzato sgRNA 30 µg/mL Lineare CAR donor dsDNA 240 µg/mL Protocollo di elettroporazione Protocollo di elettroporazione del sistema al neon n. 24 1.600 V; 10 ms; 

  Configurazione sperimentale di elettroporazione

Per dimostrare l'efficienza dell'elettroporazione su diverse scale, abbiamo testato 100 µL di sospensione cellulare sul sistema Neon e 1 mL di sospensione cellulare sul sistema CTS Xenon utilizzando la camera per elettroporazione Gibco™ CTS™ Xenon™ SingleShot su tre diversi donatori (donatori A, B , e C). Inoltre, il donatore C è stato utilizzato per aumentare il volume di elettroporazione a 18 mL sul sistema CTS Xenon utilizzando la cartuccia per elettroporazione Gibco™ Xenon™, formato MultiShot™, 5–25 mL. La densità cellulare era di 5 x 107 cellule/mL nel tampone Gibco™ CTS™ Xenon™ Genome Editing Buffer per tutti i donatori e le condizioni della scala. È stato testato anche un controllo "senza elettroporazione". Per dimostrare una strategia di modificazione genetica clinicamente rilevante, abbiamo utilizzato il sistema di elettroporazione CTS Xenon per fornire alle cellule la proteina CTS TrueCut Cas9 e lo sgRNA TrueGuide codificato TRAC insieme a un costrutto del recettore chimerico dell'antigene (CAR) dsDNA del donatore.

Strategia di gating della citometria a flusso

Il citometro a flusso Attune NxT è stato utilizzato per valutare l'efficienza ed il fenotipo dell'editing genico.  L'anticorpo V5 è stato utilizzato per rilevare una parte dell'antigene CAR sulle cellule T per quantificare quante cellule esprimevano il CAR sulla loro membrana.

Saggio di uccisione CAR T

Le cellule CAR T dei donatori A e B sono state testate per la funzionalità in un test di citotossicità (Figura 4). In breve, le cellule sono state congelate (crioconservate) il giorno 9, quindi successivamente scongelate e coltivate per 3 giorni dopo lo scongelamento per simulare la pratica clinica. Le cellule CAR T effettrici o le cellule di controllo (linfociti T citotossici non modificati (CTL)) sono state scongelate e seminate in piastre da 96 pozzetti contenenti cellule bersaglio Nalm6 marcate con proteina fluorescente verde (GFP) a rapporti effettrici a bersaglio (E: T) compresi tra 10 :1 a 0:1. Le miscele di cellule E:T sono state incubate per 6 ore e analizzate per la citotossicità percentuale utilizzando il sistema di imaging EVOS M5000 e il citometro a flusso Attune NxT.

Risultati

Vitalità ed espansione cellulare

Il successo dell'elettroporazione è un equilibrio tra l'efficienza e la vitalità della trasfezione e la vitalità post-elettroporazione superiore al 70% è generalmente considerata accettabile. La vitalità è stata valutata a 72 ore dopo l'elettroporazione ed era coerente su varie scale di volume di elettroporazione, inclusi i controlli senza elettroporazione. Questa coerenza ha dimostrato che l'elettroporazione stessa, così come il volume dell'elettroporazione, non ha alterato in modo significativo la vitalità cellulare. Inoltre, la vitalità dopo l'elettroporazione da parte del sistema CTS Xenon era ben superiore al 70% per tutti i donatori.  Vitalità cellulare misurata il giorno 6, 3 giorni dopo l'elettroporazione con il sistema CTS Xenon.  L'espansione e la vitalità cellulare sono state testate il giorno dell'elettroporazione (giorno 3) e 3 e 7 giorni dopo l'elettroporazione (giorni 6 e 10, rispettivamente). I numeri delle cellule sono stati registrati immediatamente prima dell'elettroporazione (giorno 3) e la crescita cellulare è stata valutata a 3 e 7 giorni dopo l'elettroporazione (giorni 6 e 10, rispettivamente), per garantire che le cellule modificate fossero in grado di espandersi. Le cellule di controllo solo per elettroporazione e le cellule modificate che hanno ricevuto il carico utile sono state in grado di espandersi da 25 a 35 volte nel corso di 7 giorni . Come previsto, le cellule modificate hanno mostrato un'espansione leggermente inferiore a causa dell'internalizzazione del carico utile e degli effetti fisici dell'elettroporazione. La vitalità cellulare al giorno 10 era di circa il 90% per tutti i donatori e le condizioni di elettroporazione.

Efficienza di trasfezione

Le cellule T attivate sono state geneticamente modificate con i sistemi di trasfezione Neon (100 µL) o CTS Xenon (1 mL). Le cellule sono state modificate con complessi ribonucleoproteici comprendenti CTS TrueCut Cas9 Protein e TrueGuide sgRNA che codificano per il sito TRAC. Mostra l'efficienza di editing genetico coerente; è stata osservata un'efficienza superiore con il sistema CTS Xenon (22–44% di efficienza di knock-in) rispetto al sistema Neon (15–23% di efficienza di knock-in), il che suggerisce che il sistema CTS Xenon può essere utilizzato per scalare e ottimizzare facilmente il processo di trasfezione in un sistema chiuso.

Fenotipo

Il fenotipo delle cellule T è stato valutato sul citometro a flusso Attune NxT.

 Rispetto ai controlli senza elettroporazione, vi è un cambiamento fenotipico minimo o nullo nei volumi di elettroporazione testati. C'è stato uno spostamento nel fenotipo quando si confrontano le cellule prima e dopo l'attivazione, l'elettroporazione e l'espansione, ma nessun impatto significativo dalla sola elettroporazione. .

Citotossicità

La citotossicità è stata valutata utilizzando un test di uccisione delle cellule CAR T. Dopo lo scongelamento, le cellule CAR T hanno mostrato un'espressione sostenuta del costrutto CAR e hanno dimostrato la capacità di uccidere in modo efficiente le cellule bersaglio marcate con GFP.

Conclusioni

Le linee guida per la produzione di terapie cellulari si sono evolute man mano che le agenzie di regolamentazione implementano requisiti più rigorosi nel tentativo di standardizzare queste terapie. Garantire l'idoneità di strumenti e reagenti per la produzione di terapie cellulari è una base fondamentale del design del nostro prodotto Gibco™ CTS™. Come dimostrato dall'efficienza e dalla funzionalità dell'elettroporazione delle cellule CAR T risultanti, il sistema CTS Xenon è stato progettato per aumentare le dimensioni e soddisfare i requisiti dei processi di produzione commerciale. Il sistema può essere integrato con reagenti come CTS TrueCut Cas9 Protein, nonché una gamma di prodotti e strumenti progettati per l'uso nella produzione di terapia cellulare per chiudere e ottimizzare la fase di ingegneria cellulare del processo di produzione. 

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Agilent_FFPE_App%20Note_406778/TS_PPL_Thermo%20Fisher_Cell%20Culture_App%20Note%20(Ross)%20406124/gene-modification-cell-therapy-applications-app-note%20(1).pdf?_ga=2.12060028.918276553.1673128376-47781878.1664043971