Principle of Mitochondrial Toxicity Assessment Using Agilent Seahorse XF Solution / Principio della valutazione della tossicità mitocondriale utilizzando la soluzione Agilent Seahorse XF
Principle of Mitochondrial Toxicity Assessment Using Agilent Seahorse XF Solution / Principio della valutazione della tossicità mitocondriale utilizzando la soluzione Agilent Seahorse XF
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Abstract
Agilent Seahorse XF analyzers are used to study cellular metabolism in a diverse array of research areas, including assessment of drug-induced mitochondrial toxicity. Direct measurement of mitochondrial oxygen consumption can be used as a specific and sensitive indicator to assess drug-induced mitochondrial toxicity, a common issue in therapeutic development. This white paper establishes a customized XF assay solution for the detection of mitochondrial toxicity using standardized parameters. The solution includes the following key features:
– The ability to both identify and distinguish among different modes of mitochondrial toxicity
– A standardized quantitative measurement of the magnitude of the toxicity
– A metric of assay quality and performance evaluation to establish confidence in resulting data
– A rapid, straightforward assay set up for either compound screening or dose‑response analysis
This white paper outlines the approach and design of the Agilent Seahorse XF Mito Tox assay solution with respect to the elements listed above, with a focus on the derivation of the mitochondrial toxicity index (MTI), a new standardized parameter enabling intuitive and quantitative assessment of the magnitude and type of mitochondrial toxicity.
Introduction
Mitochondrial toxicity is a common issue with therapeutic development, as most eukaryotic cells use mitochondria to produce the majority of adenosine triphosphate (ATP) required for metabolic function, and to regulate key cellular processes. Drugs can disrupt mitochondrial function in many ways (Figure 1) by inhibition of: electron transport chain (ETC) protein complexes, ATP synthase and other oxidative phosphorylation (OxPhos) components, enzymes of the tricarboxylic acid (TCA) cycle, various mitochondrial transporters, mitochondrial transcription and translational machinery, as well as by inhibition through the uncoupling of the ETC from ATP synthesis.1 Much progress has been made in the past fifteen years to develop a variety of high-throughput, applicable preclinical organelle-based and in vitro cell models, with oxygen consumption-based methods being described as the most informative and sensitive among assays used to assess mitochondrial dysfunction and toxicity. Among the methods, direct measurement of mitochondrial oxygen consumption using Agilent Seahorse XF technology has been well documented as a specific and sensitive marker/indicator.1,2 To provide an accessible and rigorous methodology for researchers who develop drugs, a customized assay kit, the Agilent Seahorse XF Mito Tox Assay Kit, was developed with dedicated workflow and analytic tools. This assay kit offers a standardized solution to identify mitochondrial toxicant compounds via direct assessment of changes in mitochondrial function. The XF Mito Tox assay design uses a modified injection strategy and automates key data calculations. In combination with the XF Pro platform, software, and consumables, this solution provides information-rich data with high sensitivity, specificity, and improved throughput using a newly defined metric, the MTI, allowing rapid and accurate interpretation of data. In addition, a metric of assay performance, Z', is used to establish and maintain high confidence in resulting data.
Approach
In the XF Mito Tox assay solution, the XF Mito Tox Assay Kit measures real-time mitochondrial function and the software features are customized for mitochondrial toxicity test to:
– Identify mitochondrial toxicity accurately and consistently with high sensitivity
– Specifically distinguish among different modes of mitochondrial toxicity
– Provide a standardized quantitative measurement of the magnitude of the toxicity
– Evaluate assay quality and establish confidence in resulting data
– Provide rapid, straightforward assay design and intuitive data interpretation for either compound-screening or dose‑response assays
Assay design XF measurement and injection strategy
The XF Mito Tox assay is a customized assay for assessing mitochondrial toxicity. This assay allows evaluation of both the type and magnitude of mitochondrial toxicity due to compound treatment. Seahorse XF technology provides standard solutions for the functional analysis of mitochondrial respiration by directly measuring OCR in real time using live cells, typically using a series of injections of reference modulators including oligomycin (OxPhos inhibitor), FCCP (uncoupler), and rotenone/antimycin A (Rot/AA, ETC inhibitors). In the XF Mito Tox assay, consecutive injections of oligomycin and FCCP are used, in combination with two control groups pretreated with vehicle and Rot/AA
Compounds to be assessed for mitochondrial toxicity are provided to the cells at a designated time prior to the assay, then OCR is measured under basal (Basal OCR), oligomycin‑induced (Oligo OCR), and FCCP-induced (FCCP OCR) conditions. Two control groups, in which the cells are treated with vehicle or Rot/AA, are required to provide positive and negative control values. FCCP and Rot/AA are also used as the reference compounds for detection of uncoupling and inhibition. Use of these mitochondrial modulators allow both the type and the magnitude of toxicity to be determined, as described in the next sections. Inhibition (decrease in FCCP OCR): If treatment with a compound results in decreased FCCP OCR, then this is defined as inhibition. Treatment of cells with an optimal concentration of FCCP will typically increase OCR to maximal rates. Under these conditions of higher substrate demand, the sensitivity of mitochondria to toxic compounds increases. Thus, if a compound treatment results in a decrease in FCCP OCR, compared to the vehicle group, this type of mitochondrial toxicity is defined as inhibition. Inhibition can be mediated by exert effects on transport, TCA cycle, FAO, ETC, or other upstream process (Figure 1), in which some component of mitochondrial function as been disrupted or inhibited (Figures 1). Note that treatment of the cells with FCCP provides the specificity required to identify inhibitors, and increases the dynamic range for detection of inhibition compared to measurement of only Basal OCR. Uncoupling (increase in Oligo OCR): If treatment with a compound results in increased Oligo OCR, then this is defined as uncoupling. Oligomycin, an inhibitor of the mitochondrial ATP synthase, will significantly reduce electron flow through the electron transport chain, resulting in a decrease of OCR, as observed with the vehicle upon injection of oligomycin. If a compound treatment results in increased Oligo OCR compared to vehicle, this type of mitochondrial toxicity is defined as uncoupling, in which the ETC has been uncoupled from the oxidative phosphorylation machinery, i.e. ATP synthase, adenine nucleotide transporter (ANT), and inorganic phosphate transporter (Pi T). This effect is usually through protonophore action of the compound, shuttling protons across the mitochondrial inner membrane from the intermembrane space (IMS) to the matrix
The result is that the mitochondria expend energy to re‑establish a proton motive force by pumping protons from the matrix to the IMS, which causes an increase in respiration rate (OCR). However, mitochondrial ATP synthesis is usually compromised or altogether abrogated, ultimately having a deleterious effect on cell metabolism. Similar to measuring FCCP OCR, measuring Oligo OCR provides the specificity required to identify uncouplers, as well as increasing the dynamic range for detection of mitochondrial toxicity due to uncoupling, when compared to measurement of only Basal OCR.
OxPhos inhibition (decease in only Basal OCR):
Suppression of OxPhos activities (i.e. ATP synthase, ANT, and Pi T) is categorized as OxPhos inhibition. While changes in Basal OCR can be used to assess mitochondrial toxicity, there are several drawbacks to inferring mitochondrial toxicity from only Basal OCR measurements. As noted above, the dynamic range of Basal OCR is less significant than the ranges of Oligo OCR or FCCP OCR. This results in lower sensitivity and often a decrease in signal-to-noise ratio. This problem is compounded by the fact that cells are often less sensitive to toxic compounds under basal respiration conditions, as the energetic demands of the cell are less. Nevertheless, Basal OCR is still informative for indicating OxPhos inhibition when only Basal OCR is inhibited significantly by a compound with neither Oligo OCR nor FCCP OCR decrease. Once a compound is identified as an OPI in this definition, then further investigation is encouraged to validate the mode of toxicity. Details of the criteria used for determination of OPI are discussed further below. In summary, based on responses in either FCCP OCR, Oligo OCR and/or Basal OCR of the test compounds compared to appropriate controls, the XF Mito Tox assay can identify three distinct types of mitochondrial toxicity:
a) direct/indirect inhibition of the ETC or other mitochondrial processes,
b) uncoupling of the ETC from OxPhos, and
c) specific inhibition of the OxPhos machinery or any potential inhibition detected only by Basal OCR.
Further, measuring OCR under bioenergetic conditions beyond basal respiration (i.e., Oligo OCR and FCCP OCR) allows for both increased specificity and sensitivity in the assessment of compounds for mitochondrial toxic effects.
Defining the mitochondrial toxicity index (MTI)
Having established an assay design that provides specificity (type of toxicity) and increased sensitivity, the next step was to devise a standardized scale on which the magnitude of toxicity is quantitated. This requires the inclusion of proper control measurements/groups in the assay to define the upper and lower boundaries of uncoupling and inhibition (i.e. to define the dynamic ranges of detecting uncoupling and inhibition). This dimensionless metric is designated as the mitochondrial toxicity index (MTI) and is derived and defined as follows.
Defining MTI for inhibition:
Mitochondrial toxicity due to inhibition is defined as a decrease in FCCP OCR of the test compound compared to the negative control measurement (i.e. 0% inhibition), which in this case is the maximal FCCP OCR of the vehicle group. Conversely, 100% inhibition is defined by the positive control measurement, which is the minimal FCCP OCR of the Rot/AA group. Derivation of the MTI value for inhibition takes the form:
Inhibtion
MTI = X — NC / NC — PC
Where: X is the maximal FCCP OCR of the test compound. NC is the negative control (maximal FCCP OCR of vehicle). PC is the positive control (minimal FCCP OCR of Rot/AA group). This can be expressed as:
Inhibtion
MTI = Max FCCP OCRTest — Max FCCP OCRVehicle / Max FCCP OCRVehicle — Min FCCP OCRRot/AA
Defining MTI for uncoupling:
Mitochondrial toxicity due to uncoupling is defined and detected as an increase in Oligo OCR of the test compound compared to the negative control measurement (i.e., 0% uncoupling), which in this case is the minimal Oligo OCR of the vehicle group. Conversely, 100% uncoupling is defined by the positive control measurement, which is the maximal FCCP OCR of the vehicle group. Derivation of the MTI value for uncoupling takes the form: Uncoupling
MTI = X — NC / PC — NC
Where: X is the maximal Oligo OCR of the test compound. NC is the negative control (minimal Oligo OCR of vehicle group). PC is the positive control (maximal FCCP OCR of vehicle group). This can be expressed as:
Uncoupling MTI = Max Oligo OCRTest — Min Oligo OCRVehicle / Max Oligo OCRVehicle — Min Oligo OCRVehicle
Applying this equation results in a positive fractional MTI value for uncoupling, typically between 0 and 1, and is illustrated and described
In summary, the MTI is the fraction value of test compound effect compared to respective controls for either uncoupling and/or inhibition. The MTI is calculated as positive index number for uncoupling and as negative index number for inhibition. The control groups and MTI scale is summarized. Upon data transformation, both MTIs for uncoupling and inhibition are generated for each well. This single intuitive parameter facilitates the interpretation of the assay results by providing information for both the magnitude (absolute value) and type of mitochondrial toxicity (positive versus negative value).
Defining mitochondrial toxicity due to OPI:
As noted above, a specific case of mitochondrial toxicity due to decreased mitochondrial function is the direct inhibition of the ATP synthase, or other components of the OxPhos machinery, which is defined as OPI. This type of inhibition typically results in a decrease in Basal OCR, while Oligo OCR and FCCP OCR are not significantly affected. To discriminate OxPhos inhibition from other modes of toxicity, the following two criteria are applied. A test compound must satisfy both criteria to be designated as OPI (if criteria 1 and criteria 2): Criteria 1: z-score for minimal Basal OCR <–3 Criteria 2: z-score for maximal FCCP OCR >–3 Z-score for Basal
OCR = χ — µ σ
Where: χ is the Basal OCR of the test compound. µ is the mean Basal OCR of vehicle group. σ is the standard deviation of Basal OCR of vehicle group. and Z-score for FCCP OCR = χ — µ σ
Where: χ is the maximal FCCP OCR of the test compound. µ is the mean of maximal FCCP OCR of the vehicle group. σ is the standard deviation of maximal FCCP OCR of the vehicle group.
Using the z-score enables for specific discrimination (p <0.005) of potential OxPhos inhibition events (versus uncoupling or inhibition) by correlating the window (criteria) of OPI detection to the standard error (i.e. noise) obtained for Basal OCR and FCCP OCR of the vehicle group. These criteria are used to decrease the chances of reporting false positives for this mode of toxicity. Compounds are detected as OPIs for mitochondrial toxicity if these criteria are met. Upon observing detection of OPI, it is encouraged to perform downstream assays (e.g. XF Mito Tox dose-response assay or other orthogonal assays) to further investigate and characterize this type of toxicity.
XF Mito Tox assay performance metrics
Having defined a quantitative metric of mitochondrial toxicity (MTI value), there is also the requirement for the evaluation of the quality of assay performance. The Z' calculated from OCR measurements for the control groups is used to assess the assay performance and ensure robust MTI output. Z', a screening window coefficient can be used as a dimensionless statistical characteristic for high-throughput screening when two extreme reference controls over the dynamic range of the measurement are used. It illustrates the assay windows where the Z's are assessed. These assay windows are used calculate MTIs for inhibitor and uncoupler. In the XF Mito Tox assay, corresponding Z' for uncoupling and inhibition are calculated as follows:
Z' = 1 – (3σPC + 3σNC) |µPC + µNC|
Where: µPC is the mean OCR of positive control. µNC is the mean OCR of negative control. σPC is the standard deviation of positive control. σNC is the standard deviation of negative control. To validate the MTI-based toxicity screening and to test the robustness and consistency of the assay, Z' across plates/days were compared by using HepG2 cells, following the standard XF Mito Tox assay protocol described in the Agilent Seahorse XF Mito Tox Assay Kit User Guide. XF Pro M plates are divided into two groups, vehicle and Rot/AA, using two reciprocal plate maps. In general, it is desired to achieve Z' of greater than 0.5 to be confident of screening assay results. The results show, for both normalized and not normalized data, Z values of >0.5 for uncoupling and inhibition are consistently obtainable and are independent of plate layout, from plate to plate or day to day. The data demonstrate that the dynamic assay window of Seahorse XF Mito Tox assay using HepG2 cells is valid for mitochondrial toxicity screening application.
Applications
The basic applications of the XF Mito Tox assay include screening of compounds at a fixed concentration and dose‑response analysis with calculation of IC50 or EC50 values. Proof-of-concept examples of these two applications using a small library of compounds known to elicit mitochondrial toxicity are provided. All assays were performed using the protocol described in the Agilent Seahorse XF Mito Tox Assay Kit User Guide6 , and the data were processed and analyzed using Agilent Seahorse Analytics.
Screening analysis
As an application example of the assay, several compounds known to elicit different mitochondrial toxicity effects (including uncoupling, direct ETC inhibition, and direct OxPhos inhibition) were evaluated with the XF Mito Tox assay. HepG2 cells were exposed to the eight compounds at a fixed concentration (100 μM) for 1 hour, then the XF Mito Tox assay was performed. The OCR measurements were transformed to MTI values for each compound using Seahorse Analytics which are presented in the bar chart and plate map views (Figure 7). In this study, the type of toxic effect was identified (inhibition, uncoupling, or OxPhos inhibition) and quantitated via the MTI values. The results are in good agreement with previous reports.7-10 For detailed discussion of results, see the Agilent application note by Kam et al.
Dose-response analysis
Another key consideration for this methodology is the effect of compound concentration on the magnitude of mitochondrial toxicity. Because MTI values are calculated for each well, this parameter can also be used to calculate doseresponse curves to assess the magnitude of toxicity with respect to compound concentration, i.e., the MTI value versus compound dose. In Seahorse Analytics, EC50 and IC50 values are calculated using the four-parameter dose-response curve fitting models based on the Hill equation.
EC50 where Hill slope >0,
MTI = Bottom + Top – Bottom / 1 + ( Hill slope )
EC50 Dose IC50 where Hill slope <0,
MTI = Bottom + (Top – Bottom) / 1 + ( Hill slope ) IC50 Dose
To demonstrate the utility of the XF Mito Tox assay in assessing the potency of mitochondrial toxic compounds, a dose-response assay was performed using two inhibitors (clofilium tosylate and risperidone) and two uncouplers (diflunisal and nimesulide). HepG2 cells were exposed to these compounds for 1 hour at 10 concentrations prior to performing the assay. As shown in Figure 8, the kinetic OCR measurements were translated into MTI-based dose‑response curves to obtain IC50 and EC50 values for inhibition and uncoupling, respectively.
Considerations for data interpretation
Effects of dose on the mode of mitochondrial toxicity:
Four compounds, including nimesulide, show typical dose responses indicative of inhibition and uncoupling with IC50 and EC50 values. However, if the concentration of nimesulide is further increased, the apparent mode of toxicity changes. At relatively low concentrations (0 to 100 µM), nimesulide behaves as an uncoupler, showing increases in Oligo OCR with little to no impact in FCCP OCR. But as the concentration increases (100 µM to 2 mM), the uncoupling MTI drops from 0.55 to 0, while, concomitantly, the magnitude of inhibition increases from –0.05 to –1 (Figure 9A). This behavior is, in fact, expected for many uncouplers, exhibiting uncoupling effects at relatively low concentrations and inhibitory effects at high concentrations13, and illustrates the benefit of performing dose-response analysis after initial compound-screening assays. This dose-dependent shift in the mode of mitochondrial toxicity is also observed for some OPIs. For example, oligomycin, DCCD, and pentamidine isethionate are known ATPase inhibitors (OPIs). In the screening assay shown in Figure 7, pentamidine isethionate is detected as an OPI. However, DCCD showed an MTI value of –0.26, but was not detected as an OPI. Performing a dose-response assay following the screening assay revealed two distinct types of outcomes. In the case of oligomycin and pentamidine isethionate, OPI is reported across the testing concentration ranges, suggesting specific inhibition of a component of the OxPhos system. In contrast, in the case of DCCD, OxPhos inhibition is observed only at the lowest concentration tested (25 μM), while at higher concentrations, this compound elicits inhibitory activity. These cases illustrate that if understanding the mode of mitochondrial toxicity is relevant to the investigation, then downstream assays beyond initial single-dose screening, such as dose‑dependent compound exposure may be necessary
Considerations for data interpretation
Effects of dose on the mode of mitochondrial toxicity: four compounds, including nimesulide, show typical dose responses indicative of inhibition and uncoupling with IC50 and EC50 values. However, if the concentration of nimesulide is further increased, the apparent mode of toxicity changes. At relatively low concentrations (0 to 100 µM), nimesulide behaves as an uncoupler, showing increases in Oligo OCR with little to no impact in FCCP OCR. But as the concentration increases (100 µM to 2 mM), the uncoupling MTI drops from 0.55 to 0, while, concomitantly, the magnitude of inhibition increases from –0.05 to –1. This behavior is, in fact, expected for many uncouplers, exhibiting uncoupling effects at relatively low concentrations and inhibitory effects at high concentrations13, and illustrates the benefit of performing dose-response analysis after initial compound-screening assays. This dose-dependent shift in the mode of mitochondrial toxicity is also observed for some OPIs. For example, oligomycin, DCCD, and pentamidine isethionate are known ATPase inhibitors (OPIs). In the screening assay, pentamidine isethionate is detected as an OPI. However, DCCD showed an MTI value of –0.26, but was not detected as an OPI. Performing a dose-response assay following the screening assay revealed two distinct types of outcomes. In the case of oligomycin and pentamidine isethionate, OPI is reported across the testing concentration ranges, suggesting specific inhibition of a component of the OxPhos system. In contrast, in the case of DCCD, OxPhos inhibition is observed only at the lowest concentration tested (25 μM), while at higher concentrations, this compound elicits inhibitory activity. These cases illustrate that if understanding the mode of mitochondrial toxicity is relevant to the investigation, then downstream assays beyond initial single-dose screening, such as dose‑dependent compound exposure may be necessary.
Conclusion
In summary, direct measurement of mitochondrial oxygen consumption is a specific and sensitive indicator to assess drug-induced mitochondrial toxicity, a common issue in therapeutic development. This white paper introduces the Agilent Seahorse XF Mito Tox assay, a customized assay, which is used to assess mitochondrial toxicity, and has the ability to identify and specifically distinguish among different modes of mitochondrial toxicity with high sensitivity. Further, this assay introduces a standardized quantitative measurement of the magnitude of toxicity: the MTI. In addition, to provide assurance of resulting data quality, a metric of assay performance is provided (Z'). This assay design and respective output parameters enable both rapid, straightforward implementation and intuitive, confident data interpretation for either screening or dose-response types of assays when examining mitochondrial toxicity of therapeutic compounds.
ITALIANO
Riassunto
Gli analizzatori Agilent Seahorse XF vengono utilizzati per studiare il metabolismo cellulare in una vasta gamma di aree di ricerca, inclusa la valutazione della tossicità mitocondriale indotta da farmaci. La misurazione diretta del consumo di ossigeno mitocondriale può essere utilizzata come indicatore specifico e sensibile per valutare la tossicità mitocondriale indotta da farmaci, un problema comune nello sviluppo terapeutico. Questo libro bianco stabilisce una soluzione di analisi XF personalizzata per il rilevamento della tossicità mitocondriale utilizzando parametri standardizzati. La soluzione include le seguenti funzionalità chiave:
– La capacità di identificare e distinguere tra diverse modalità di tossicità mitocondriale
– Una misurazione quantitativa standardizzata dell'entità della tossicità
– Una metrica della qualità del test e della valutazione delle prestazioni per stabilire la fiducia nei dati risultanti
– Un test rapido e semplice impostato per lo screening dei composti o l'analisi dose-risposta
Questo white paper delinea l'approccio e la progettazione della soluzione di analisi Agilent Seahorse XF Mito Tox rispetto agli elementi sopra elencati, con particolare attenzione alla derivazione dell'indice di tossicità mitocondriale (MTI), un nuovo parametro standardizzato che consente una valutazione intuitiva e quantitativa di l'entità e il tipo di tossicità mitocondriale.
Introduzione
La tossicità mitocondriale è un problema comune con lo sviluppo terapeutico, poiché la maggior parte delle cellule eucariotiche utilizza i mitocondri per produrre la maggior parte dell'adenosina trifosfato (ATP) necessaria per la funzione metabolica e per regolare i processi cellulari chiave. I farmaci possono interrompere la funzione mitocondriale in molti modi (Figura 1) mediante l'inibizione di: complessi proteici della catena di trasporto degli elettroni (ETC), ATP sintasi e altri componenti della fosforilazione ossidativa (OxPhos), enzimi del ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA), vari trasportatori mitocondriali, trascrizione mitocondriale e macchinario traslazionale, nonché per inibizione attraverso il disaccoppiamento dell'ETC dalla sintesi di ATP. modelli, con metodi basati sul consumo di ossigeno descritti come i più informativi e sensibili tra i test utilizzati per valutare la disfunzione e la tossicità mitocondriale. Tra i metodi, la misurazione diretta del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando la tecnologia Agilent Seahorse XF è stata ben documentata come marcatore/indicatore specifico e sensibile. Fornire una metodologia accessibile e rigorosa per i ricercatori che sviluppano farmaci, è stato sviluppato un kit di analisi personalizzato, l'Agilent Seahorse XF Mito Tox Assay Kit, con flussi di lavoro e strumenti analitici dedicati. Questo kit di analisi offre una soluzione standardizzata per identificare i composti tossici mitocondriali attraverso la valutazione diretta dei cambiamenti nella funzione mitocondriale. Il progetto del test XF Mito Tox utilizza una strategia di iniezione modificata ed automatizza i calcoli dei dati chiave. In combinazione con la piattaforma, il software ed i materiali di consumo XF Pro, questa soluzione fornisce dati ricchi di informazioni con elevata sensibilità, specificità e produttività migliorata utilizzando una metrica di nuova definizione, l'MTI, che consente un'interpretazione rapida e accurata dei dati. Inoltre, viene utilizzata una metrica delle prestazioni del test, Z', per stabilire e mantenere un'elevata affidabilità nei dati risultanti.
Approccio
Nella soluzione di analisi XF Mito Tox, il kit XF Mito Tox Assay misura la funzione mitocondriale in tempo reale e le funzionalità del software sono personalizzate per il test di tossicità mitocondriale per:
– Identificare la tossicità mitocondriale in modo accurato e coerente con un'elevata sensibilità
– Distinguere in modo specifico tra diverse modalità di tossicità mitocondriale
– Fornire una misurazione quantitativa standardizzata dell'entità della tossicità
– Valutare la qualità del test e stabilire la fiducia nei dati risultanti
– Fornire un design rapido e diretto del test e un'interpretazione intuitiva dei dati per i test di screening dei composti o dose-risposta
Progettazione del saggio Misurazione di XF e strategia di iniezione
Il test XF Mito Tox è un test personalizzato per valutare la tossicità mitocondriale. Questo test consente di valutare sia il tipo che l'entità della tossicità mitocondriale dovuta al trattamento composto. La tecnologia Seahorse XF fornisce soluzioni standard per l'analisi funzionale della respirazione mitocondriale misurando direttamente l'OCR in tempo reale utilizzando cellule vive, tipicamente utilizzando una serie di iniezioni di modulatori di riferimento tra cui oligomicina (inibitore di OxPhos), FCCP (disaccoppiatore) e rotenone/antimicina A (Rot/AA, inibitori ETC). Nel saggio XF Mito Tox vengono utilizzate iniezioni consecutive di oligomicina e FCCP, in combinazione con due gruppi di controllo pretrattati con veicolo e Rot/AA
I composti da valutare per la tossicità mitocondriale vengono forniti alle cellule in un momento prestabilito prima del test, quindi l'OCR viene misurato in condizioni basali (Basal OCR), indotte da oligomicina (Oligo OCR) e indotte da FCCP (FCCP OCR). Sono necessari due gruppi di controllo, in cui le cellule sono trattate con veicolo o Rot/AA per fornire valori di controllo positivi e negativi. FCCP e Rot/AA sono usati anche come composti di riferimento per il rilevamento del disaccoppiamento e dell'inibizione. L'uso di questi modulatori mitocondriali consente di determinare sia il tipo che l'entità della tossicità, come descritto nelle sezioni successive. Inibizione (diminuzione dell'OCR FCCP): se il trattamento con un composto determina una diminuzione dell'OCR FCCP, allora questo è definito come inibizione. Il trattamento delle cellule con una concentrazione ottimale di FCCP aumenterà tipicamente l'OCR ai tassi massimi. In queste condizioni di maggiore richiesta di substrato, aumenta la sensibilità dei mitocondri ai composti tossici. Pertanto, se un trattamento composto comporta una diminuzione dell'OCR FCCP, rispetto al gruppo veicolo, questo tipo di tossicità mitocondriale è definita come inibizione. L'inibizione può essere mediata esercitando effetti sul trasporto, ciclo TCA, FAO, ETC o altri processi a monte (Figura 1), in cui alcuni componenti della funzione mitocondriale sono stati interrotti o inibiti (Figure 1). Si noti che il trattamento delle cellule con FCCP fornisce la specificità necessaria per identificare gli inibitori e aumenta l'intervallo dinamico per il rilevamento dell'inibizione rispetto alla misurazione del solo OCR basale. Disaccoppiamento (aumento dell'Oligo OCR): se il trattamento con un composto comporta un aumento dell'Oligo OCR, questo viene definito disaccoppiamento. L'oligomicina, un inibitore dell'ATP sintasi mitocondriale, ridurrà significativamente il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni, determinando una diminuzione dell'OCR, come osservato con il veicolo dopo l'iniezione di oligomicina. Se un trattamento composto risulta in un aumento di Oligo OCR rispetto al veicolo, questo tipo di tossicità mitocondriale è definito come disaccoppiamento, in cui l'ETC è stato disaccoppiato dal meccanismo di fosforilazione ossidativa, cioè ATP sintasi, trasportatore di nucleotidi di adenina (ANT) e fosfato inorganico trasportatore (Pi T). Questo effetto è solitamente dovuto all'azione protonofora del composto, che sposta i protoni attraverso la membrana interna mitocondriale dallo spazio intermembrana (IMS) alla matrice
Il risultato è che i mitocondri spendono energia per ristabilire una forza motrice protonica pompando protoni dalla matrice all'IMS, che provoca un aumento della frequenza respiratoria (OCR). Tuttavia, la sintesi mitocondriale di ATP è solitamente compromessa o del tutto abrogata, avendo in ultima analisi un effetto deleterio sul metabolismo cellulare. Simile alla misurazione FCCP OCR, la misurazione Oligo OCR fornisce la specificità richiesta per identificare i disaccoppiatori, oltre ad aumentare la gamma dinamica per il rilevamento della tossicità mitocondriale dovuta al disaccoppiamento, rispetto alla misurazione del solo OCR basale.
Inibizione di OxPhos (decesso solo in OCR basale):
La soppressione delle attività di OxPhos (cioè ATP sintasi, ANT e Pi T) è classificata come inibizione di OxPhos. Mentre i cambiamenti nell'OCR basale possono essere utilizzati per valutare la tossicità mitocondriale, ci sono diversi inconvenienti nell'inferire la tossicità mitocondriale solo dalle misurazioni dell'OCR basale. Come notato sopra, l'intervallo dinamico di Basal OCR è meno significativo degli intervalli di Oligo OCR o FCCP OCR. Ciò si traduce in una minore sensibilità e spesso in una diminuzione del rapporto segnale/rumore. Questo problema è aggravato dal fatto che le cellule sono spesso meno sensibili ai composti tossici in condizioni di respirazione basale, poiché le richieste energetiche della cellula sono inferiori. Tuttavia, l'OCR basale è ancora informativo per indicare l'inibizione di OxPhos quando solo l'OCR basale è inibito in modo significativo da un composto senza diminuzione dell'OCR Oligo né dell'OCR FCCP. Una volta che un composto viene identificato come OPI in questa definizione, sono incoraggiate ulteriori indagini per convalidare la modalità di tossicità. I dettagli dei criteri utilizzati per la determinazione dell'OPI sono discussi più avanti. In sintesi, sulla base delle risposte in FCCP OCR, Oligo OCR e/o Basal OCR dei composti in esame rispetto ai controlli appropriati, il test XF Mito Tox può identificare tre tipi distinti di tossicità mitocondriale:
a) inibizione diretta/indiretta dell'ETC o altri processi mitocondriali,
b) disaccoppiamento dell'ETC da OxPhos e
c) inibizione specifica del macchinario OxPhos o qualsiasi potenziale inibizione rilevata solo dall'OCR basale. Inoltre, la misurazione dell'OCR in condizioni bioenergetiche oltre la respirazione basale (ovvero Oligo OCR e FCCP OCR) consente sia una maggiore specificità che sensibilità nella valutazione dei composti per gli effetti tossici mitocondriali.
Definizione dell'indice di tossicità mitocondriale (MTI)
Avendo stabilito un progetto di analisi che fornisce specificità (tipo di tossicità) e maggiore sensibilità, il passo successivo è stato ideare una scala standardizzata su cui quantificare l'entità della tossicità. Ciò richiede l'inclusione di misurazioni/gruppi di controllo adeguati nel saggio per definire i limiti superiore e inferiore del disaccoppiamento e dell'inibizione (ovvero per definire gli intervalli dinamici di rilevamento del disaccoppiamento e dell'inibizione). Questa metrica adimensionale è designata come indice di tossicità mitocondriale (MTI) ed è derivata e definita come segue.
Definizione di MTI per inibizione:
La tossicità mitocondriale dovuta all'inibizione è definita come una diminuzione dell'FCCP OCR del composto in esame rispetto alla misurazione del controllo negativo (ovvero 0% di inibizione), che in questo caso è l'FCCP OCR massimo del gruppo veicolo. Al contrario, l'inibizione al 100% è definita dalla misurazione del controllo positivo, che è l'OCR FCCP minimo del gruppo Rot/AA. La derivazione del valore MTI per l'inibizione assume la forma:
Inibizione
MTI = X — NC / NC — PC
Dove: X è l'OCR FCCP massimo del composto in esame. NC è il controllo negativo (FCCP OCR massimo del veicolo). PC è il controllo positivo (FCCP OCR minimo del gruppo Rot/AA). Questo può essere espresso come:
Inibizione
MTI = Max FCCP OCRTest — Max FCCP OCRVehicle / Max FCCP OCRVehicle — Min FCCP OCRRot/AA
Definizione di MTI per il disaccoppiamento:
La tossicità mitocondriale dovuta al disaccoppiamento è definita e rilevata come un aumento dell'Oligo OCR del composto in esame rispetto alla misurazione del controllo negativo (ovvero, 0% disaccoppiamento), che in questo caso è l'Oligo OCR minimo del gruppo veicolo. Al contrario, il disaccoppiamento al 100% è definito dalla misurazione del controllo positivo, che è l'FCCP OCR massimo del gruppo di veicoli. La derivazione del valore MTI per il disaccoppiamento assume la forma: Disaccoppiamento
MTI = X — NC / PC — NC
Dove: X è il massimo Oligo OCR del composto in esame. NC è il controllo negativo (minimo Oligo OCR del gruppo di veicoli). PC è il controllo positivo (FCCP OCR massimo del gruppo di veicoli). Questo può essere espresso come:
Disaccoppiamento MTI = Max Oligo OCRTest — Min Oligo OCRVehicle / Max Oligo OCRVehicle — Min Oligo OCRVehicle
L'applicazione di questa equazione si traduce in un valore MTI frazionario positivo per il disaccoppiamento, tipicamente compreso tra 0 e 1, ed è illustrato e descritto
In sintesi, l'MTI è il valore della frazione dell'effetto del composto in esame rispetto ai rispettivi controlli per il disaccoppiamento e/o l'inibizione. L'MTI è calcolato come numero indice positivo per il disaccoppiamento e come numero indice negativo per l'inibizione. I gruppi di controllo e la scala MTI sono riassunti. Dopo la trasformazione dei dati, per ogni pozzetto vengono generati entrambi gli MTI per il disaccoppiamento e l'inibizione. Questo singolo parametro intuitivo facilita l'interpretazione dei risultati del test fornendo informazioni sia per l'entità (valore assoluto) che per il tipo di tossicità mitocondriale (valore positivo rispetto a valore negativo).
Definizione di tossicità mitocondriale dovuta a OPI:
Come notato sopra, un caso specifico di tossicità mitocondriale dovuta alla ridotta funzione mitocondriale è l'inibizione diretta dell'ATP sintasi, o di altri componenti del macchinario OxPhos, che è definito come OPI. Questo tipo di inibizione si traduce tipicamente in una diminuzione dell'OCR basale, mentre Oligo OCR e FCCP OCR non sono influenzati in modo significativo. Per discriminare l'inibizione di OxPhos da altre modalità di tossicità, vengono applicati i seguenti due criteri. Un composto di prova deve soddisfare entrambi i criteri per essere designato come OPI (se criteri 1 e criteri 2): Criterio 1: punteggio z per OCR basale minimo <–3 Criterio 2: punteggio z per OCR FCCP massimo >–3 punteggio Z per basale
OCR = χ — µ σ
Dove: χ è l'OCR basale del composto in esame. µ è l'OCR basale medio del gruppo di veicoli. σ è la deviazione standard dell'OCR basale del gruppo di veicoli. e punteggio Z per FCCP OCR = χ — µ σ
Dove: χ è l'OCR FCCP massimo del composto in esame. µ è la media dell'OCR FCCP massimo del gruppo di veicoli. σ è la deviazione standard dell'OCR FCCP massimo del gruppo di veicoli.
L'utilizzo del punteggio z consente la discriminazione specifica (p <0,005) di potenziali eventi di inibizione OxPhos (rispetto al disaccoppiamento o all'inibizione) correlando la finestra (criteri) di rilevamento OPI all'errore standard (ovvero rumore) ottenuto per OCR basale e OCR FCCP del gruppo di veicoli. Questi criteri vengono utilizzati per ridurre le possibilità di segnalare falsi positivi per questa modalità di tossicità. I composti vengono rilevati come OPI per la tossicità mitocondriale se questi criteri sono soddisfatti. Dopo aver osservato il rilevamento di OPI, si consiglia di eseguire analisi a valle (ad es. analisi dose-risposta XF Mito Tox o altre analisi ortogonali) per indagare ulteriormente e caratterizzare questo tipo di tossicità.
Metriche delle prestazioni del test XF Mito Tox
Avendo definito una metrica quantitativa della tossicità mitocondriale (valore MTI), vi è anche il requisito per la valutazione della qualità delle prestazioni del saggio. La Z' calcolata dalle misurazioni OCR per i gruppi di controllo viene utilizzata per valutare le prestazioni del test e garantire un output MTI robusto. Z', un coefficiente della finestra di screening può essere utilizzato come caratteristica statistica adimensionale per lo screening ad alto rendimento quando vengono utilizzati due controlli di riferimento estremi sull'intervallo dinamico della misurazione. Vengono illustrate le finestre di analisi in cui vengono valutate le Z. Queste finestre di analisi vengono utilizzate per calcolare gli MTI per l'inibitore e il disaccoppiatore. Nel saggio XF Mito Tox, i corrispondenti Z' per il disaccoppiamento e l'inibizione sono calcolati come segue:
Z' = 1 – (3σPC + 3σNC) |µPC + µNC|
Dove: µPC è l'OCR medio del controllo positivo. µNC è l'OCR medio del controllo negativo. σPC è la deviazione standard del controllo positivo. σNC è la deviazione standard del controllo negativo. Per convalidare lo screening della tossicità basato su MTI e per testare la robustezza e la coerenza del test, Z' su piastre/giorni sono stati confrontati utilizzando cellule HepG2, seguendo il protocollo standard del test XF Mito Tox descritto nel kit Agilent Seahorse XF Mito Tox Assay Guida utente. Le targhe XF Pro M sono divise in due gruppi, veicolo e Rot/AA, utilizzando due mappe di targhe reciproche. In generale, si desidera ottenere Z' maggiore di 0,5 per essere sicuri dei risultati del saggio di screening. I risultati mostrano, sia per i dati normalizzati che per quelli non normalizzati, valori Z >0,5 per il disaccoppiamento e l'inibizione sono costantemente ottenibili e sono indipendenti dal layout della piastra, da piastra a piastra o giorno per giorno. I dati dimostrano che la finestra del saggio dinamico del saggio Seahorse XF Mito Tox che utilizza cellule HepG2 è valida per l'applicazione di screening della tossicità mitocondriale.
Applicazioni
Le applicazioni di base del test XF Mito Tox includono lo screening di composti a una concentrazione fissa e l'analisi dose-risposta con il calcolo dei valori IC50 o EC50. Vengono forniti esempi dimostrativi di queste due applicazioni utilizzando una piccola libreria di composti noti per provocare tossicità mitocondriale. Tutti i test sono stati eseguiti utilizzando il protocollo descritto nella Agilent Seahorse XF Mito Tox Assay Kit User Guide6 e i dati sono stati elaborati e analizzati utilizzando Agilent Seahorse Analytics.
Analisi dello screening
Come esempio di applicazione del test, diversi composti noti per provocare diversi effetti di tossicità mitocondriale (tra cui disaccoppiamento, inibizione diretta dell'ETC e inibizione diretta di OxPhos) sono stati valutati con il test XF Mito Tox. Le cellule HepG2 sono state esposte agli otto composti a una concentrazione fissa (100 μM) per 1 ora, quindi è stato eseguito il test XF Mito Tox. Le misurazioni OCR sono state trasformate in valori MTI per ciascun composto utilizzando Seahorse Analytics che sono presentati nelle visualizzazioni del grafico a barre e della mappa delle lastre. In questo studio è stato identificato il tipo di effetto tossico (inibizione, disaccoppiamento o inibizione OxPhos) e quantificato tramite i valori MTI. I risultati sono in buon accordo con i rapporti precedenti.7-10 Per una discussione dettagliata dei risultati, vedere la nota applicativa Agilent di Kam et al.
Analisi dose-risposta
Un'altra considerazione chiave per questa metodologia è l'effetto della concentrazione del composto sull'entità della tossicità mitocondriale. Poiché i valori MTI sono calcolati per ciascun pozzetto, questo parametro può essere utilizzato anche per calcolare le curve dose-risposta per valutare l'entità della tossicità rispetto alla concentrazione del composto, ovvero il valore MTI rispetto alla dose del composto. In Seahorse Analytics, i valori EC50 e IC50 vengono calcolati utilizzando i modelli di adattamento della curva dose-risposta a quattro parametri basati sull'equazione di Hill. EC50 dove Hill slope >0,
MTI = Basso + Alto – Basso / 1 + ( Pendenza collinare )
EC50 Dose IC50 dove Hill slope <0,
MTI = Basso + (Alto – Basso) / 1 + ( Pendio collinare ) IC50 Dose
Per dimostrare l'utilità del test XF Mito Tox nella valutazione della potenza dei composti tossici mitocondriali, è stato eseguito un test dose-risposta utilizzando due inibitori (clofilium tosylate e risperidone) e due disaccoppiatori (diflunisal e nimesulide). Le cellule HepG2 sono state esposte a questi composti per 1 ora a 10 concentrazioni prima di eseguire il test. Come mostrato nella Figura 8, le misurazioni OCR cinetiche sono state tradotte in curve dose-risposta basate su MTI per ottenere rispettivamente i valori IC50 e EC50 per l'inibizione e il disaccoppiamento.
Considerazioni per l'interpretazione dei dati
Effetti della dose sulla modalità della tossicità mitocondriale:
Quattro composti, inclusa la nimesulide, mostrano tipiche risposte alla dose indicative di inibizione e disaccoppiamento con i valori IC50 e EC50. Tuttavia, se la concentrazione di nimesulide viene ulteriormente aumentata, la modalità apparente della tossicità cambia. A concentrazioni relativamente basse (da 0 a 100 µM), la nimesulide si comporta come un disaccoppiante, mostrando aumenti nell'OCR di Oligo con un impatto minimo o nullo nell'OCR FCCP. Ma all'aumentare della concentrazione (da 100 µM a 2 mM), l'MTI di disaccoppiamento scende da 0,55 a 0, mentre, in concomitanza, l'entità dell'inibizione aumenta da –0,05 a –1 . Questo comportamento è, infatti, previsto per molti disaccoppiatori, esibendo effetti di disaccoppiamento a concentrazioni relativamente basse ed effetti inibitori a concentrazioni elevate, e illustra il vantaggio dell'esecuzione di analisi dose-risposta dopo i test iniziali di screening dei composti. Questo cambiamento dose-dipendente nella modalità di tossicità mitocondriale si osserva anche per alcuni OPI. Ad esempio, oligomicina, DCCD e pentamidina isetionato sono noti inibitori dell'ATPasi (OPI). Nel test di screening l'isetionato di pentamidina viene rilevato come OPI. Tuttavia, DCCD ha mostrato un valore MTI di -0,26, ma non è stato rilevato come OPI. L'esecuzione di un test dose-risposta dopo il test di screening ha rivelato due tipi distinti di risultati. Nel caso dell'oligomicina e della pentamidina isetionato, l'OPI viene riportato negli intervalli di concentrazione del test, suggerendo un'inibizione specifica di un componente del sistema OxPhos. Al contrario, nel caso di DCCD, l'inibizione di OxPhos si osserva solo alla concentrazione più bassa testata (25 μM), mentre a concentrazioni più elevate, questo composto suscita attività inibitoria. Questi casi illustrano che se la comprensione della modalità della tossicità mitocondriale è rilevante per l'indagine, possono essere necessari test a valle oltre lo screening iniziale a dose singola, come l'esposizione al composto dose-dipendente
Considerazioni per l'interpretazione dei dati
Effetti della dose sulla modalità della tossicità mitocondriale: come mostrato, quattro composti, inclusa la nimesulide, mostrano tipiche risposte alla dose indicative di inibizione e disaccoppiamento con i valori IC50 e EC50. Tuttavia, se la concentrazione di nimesulide viene ulteriormente aumentata, la modalità apparente della tossicità cambia. A concentrazioni relativamente basse (da 0 a 100 µM), la nimesulide si comporta come un disaccoppiante, mostrando aumenti nell'OCR di Oligo con un impatto minimo o nullo nell'OCR FCCP. Ma all'aumentare della concentrazione (da 100 µM a 2 mM), l'MTI di disaccoppiamento scende da 0,55 a 0, mentre, in concomitanza, l'entità dell'inibizione aumenta da –0,05 a –1. Questo comportamento è, infatti, previsto per molti disaccoppiatori, esibendo effetti di disaccoppiamento a concentrazioni relativamente basse ed effetti inibitori a concentrazioni elevate13, e illustra il vantaggio dell'esecuzione di analisi dose-risposta dopo i test iniziali di screening dei composti. Questo cambiamento dose-dipendente nella modalità di tossicità mitocondriale si osserva anche per alcuni OPI. Ad esempio, oligomicina, DCCD e pentamidina isetionato sono noti inibitori dell'ATPasi (OPI). Nel test di screening mostrato, l'isetionato di pentamidina viene rilevato come OPI. Tuttavia, DCCD ha mostrato un valore MTI di -0,26, ma non è stato rilevato come OPI. L'esecuzione di un test dose-risposta dopo il test di screening ha rivelato due tipi distinti di risultati. Nel caso dell'oligomicina e della pentamidina isetionato, l'OPI viene riportato negli intervalli di concentrazione del test, suggerendo un'inibizione specifica di un componente del sistema OxPhos. Al contrario, nel caso di DCCD, l'inibizione di OxPhos si osserva solo alla concentrazione più bassa testata (25 μM), mentre a concentrazioni più elevate, questo composto suscita attività inibitoria. Questi casi illustrano che se la comprensione della modalità della tossicità mitocondriale è rilevante per l'indagine, possono essere necessari test a valle oltre lo screening iniziale a dose singola, come l'esposizione al composto dose-dipendente.
Da:
https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Agilent/2022/July/Michelle/wp-principle-of-mitochondrial-toxicity-assessment-5994-4732en-agilent.pdf?__hstc=8807082.f3ddaa81584799eacca500769af88bed.1664789177252.1678658856576.1679007508639.52&__hssc=8807082.1.1679007508639&__hsfp=3757479117&hsCtaTracking=96051cb2-8b84-42fa-bd2b-c1c415eab068%7Cfc65538a-8fcd-4d95-8857-1e041efaad4e
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