How mass spectrometry proteomics is transforming life sciences research / In che modo la proteomica della spettrometria di massa sta trasformando la ricerca nelle scienze della vita

 How mass spectrometry proteomics is transforming life sciences research / In che modo la proteomica della spettrometria di massa sta trasformando la ricerca nelle scienze della vita

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Fig. Comparison of (a) mass spectrometry, (b) antibody-based, and (c) aptamer-based proteomics techniques. / Confronto di (a) spettrometria di massa, (b) tecniche di proteomica basate su anticorpi e (c) basate su aptameri. 

INTRODUCTION

The development of next-generation DNA sequencing transformed our understanding of genomics, offering an unprecedented view into variation in the human genome across health and disease. But while these technologies are useful, they cannot provide the full picture of what’s happening inside cells, tissues, and organisms. For this, we need to look at the ultimate output of the genome: the proteome. After many years in the shadow of genomics, proteomics is now ready to step into the spotlight. At Biognosys, our mass spectrometry proteomics platforms allow us to investigate the expression, function, structure, and post-translational modifications of proteins as never before – unlocking a new realm of biological information and insights. In this ebook, we’ll take you through the latest developments in mass spectrometry proteomics. We’ll start with the fundamentals of mass spectrometry proteomics and its advantages for offering deeper, actionable insights that go beyond genomics, transcriptomics and other proteomics methods. We’ll also cover recent advances in proteomics, including new milestones in depth, coverage and throughput, and developments in analytical software spearheaded by Biognosys. There is so much more to be explored at the frontiers of proteomics - it’s time to step into the next dimension.

TRANSFORMATIVE PROTEOMICS INSIGHTS FROM DISCOVERY TO CLINIC

 At Biognosys, we believe that we can dramatically improve human health by deciphering the biological complexity of diseases. By providing access to the proteome on all levels, we enable life science researchers and drug hunters to unlock true discoveries. We push the boundaries of what is possible with our proteomics solutions to help usher in a new age of bioengineering and precision medicine.

PROTEOMICS: THE FUNDAMENTALS

WHAT IS PROTEOMICS?

Proteins are the most complex biomolecules in existence. Their staggering structural diversity and post-translational modifications enable them to perform a wide range of functions. A deep understanding of the proteome is therefore key to understanding biology, health and disease pathways, and is a vital tool in the search for more effective therapies and even cures.

Understanding the Proteome

A proteome is the entirety of proteins produced by a living system. It is analogous to the genome as the complete set of an organism’s genes. However, proteomes are subject to change in response to various internal and external factors, unlike genomes which are more stable. Proteomics is focused on studying the entire set of proteins expressed by an organism, tissue, or cell at a particular moment. It allows the characterization of the expression, function, and structure of proteins, each of which is key to fully interpreting protein life cycles and interactomics. Slight changes to the proteome can have a dramatic impact on the state of a living system. Using proteomics to quantify thousands of proteins at a time allows us to identify aberrant pathways, to characterize the action of new compounds, or to uncover new biomarkers for clinical research.

WHAT IS MASS SPECTROMETRY PROTEOMICS?

Mass spectrometry (MS)-based proteomics is capable of peptide-level identification and quantification of thousands of proteins simultaneously at high speed and precision. MS not only allows us to quantify the differential expression of the whole proteome but also to understand post-translational modifications of proteins, proteinprotein interactions and even structural changes to the proteome. 

What Is Mass Spectrometry Proteomics? 

MS is one of the mainstays of proteomics. Technical advances in the field such as data analytics, instrumentation, and general workflow improvements have enabled greater depth, robustness, reproducibility and scalability in proteomics, empowering researchers to identify and quantify proteins on a proteome-wide scale. MS-based proteomics includes an expanding collection of technologies that enable high throughput characterization and quantification of proteins in a biological system. While the genome sequence provides a detailed snapshot of the biological complexity of an organism, activity that occurs at the protein-level cannot be deduced by genomic or even transcriptomic analysis. Therefore, a proteomics approach can be used in combination or in place of other ‘omics’ technologies to bridge the gap between genotype and phenotype and provide the most comprehensive approach for profiling proteins, including their interactions and modifications. 

How Does Mass Spectrometry Proteomics Work?

 The most common mass spectrometry method for studying proteins is described as ‘bottom-up’ proteomics, which begins by cleaving a mixture of proteins into peptides. This mixture is separated via liquid chromatography before being ionized and analyzed in the mass spectrometer.

Mass spectrometers comprise three main components: an ion source, a mass analyzer, and a detector. Using a high voltage, liquid phase peptides are converted into gaseous ions that are fed into the mass analyzer, where they are separated by their mass-to-charge ratios (m/z). An electrical detector records what is known as a spectrum pattern, which represents the number of ions per m/z. This spectrum can be interpreted to identify the molecules that make up proteins in the original sample. In the context of proteomics, mass spectrometry is an invaluable tool as it enables unprecedented specificity and outstanding depths of quantification. Additionally, tandem mass spectrometry, whereby multiple analyzers are coupled together to maximize the number of identified peptides in complex mixtures, can provide exquisitely detailed information on amino acid sequences.

COMPARING MASS SPECTROMETRY PROTEOMICS WITH OTHER APPROACHES

Currently, two classes of proteomics technologies are widely used in high throughput studies: mass spectrometry and affinity-based proteomics. Here, we cover how each technique works, and their advantages and disadvantages. 

Affinity-based Proteomics

 Affinity proteomics techniques rely on the use of molecules such as aptamers or antibodies, which bind specifically to known protein domains, for target detection and quantification. These tools typically overcome the problem of a broad range of protein concentrations by using multiple sample dilution steps and signal amplification. Although high specificity is often possible, affinity-based techniques rely on the availability and binding accessibility of antibodies or aptamers for known protein domains. Therefore, they cannot uncover new or unexpected molecules and may miss vital post-translational modifications or isoforms. Furthermore, when you use a proteomics company that employs an affinity-based technique they typically do not share the full data or analytical details, such as which antibodies are used.

Mass Spectrometry Proteomics 

Mass spectrometry proteomics approaches directly identify and quantify peptide fragments across the entire proteome following enzymatic digestion. Conventional mass spectrometry workflows use data-dependent acquisition (DDA) to detect and quantify known proteins, resulting in biased identification and quantification of peptides and an under-representation of low abundance molecules. By contrast, Biognosys has pioneered the use of data-independent acquisition (DIA), which detects and quantifies all proteins within a sample. This provides an unbiased approach for discovery proteomics, which is not possible with DDA mass spectrometry or affinity-based techniques.

DIA mass spectrometry can also provide structural information about protein conformation and identify post-translational modifications, neither of which can be detected with affinity-based methods. As a result, mass spectrometry can explore and test different hypotheses and reveal more complex biology than affinitybased techniques, pushing forward true discovery. Our plasma depletion workflow also overcomes the problem of a large dynamic range of protein concentrations in the blood, removing many of the most highly abundant proteins to enable deep quantification of low abundance proteins. Our depletion method is automated and standardized to ensure high sensitivity and reproducibility across thousands of samples and multiple timepoints.

THE BIOGNOSYS APPROACH TO MASS SPECTROMETRY PROTEOMICS

At Biognosys, we have developed next-generation methods for measuring proteins at this proteome-wide scale. We deploy enhanced mass spectrometry with parallel data acquisition of peptide signals for the deepest possible coverage of complete proteomes. Using proprietary software for protein identification and quantification tools based on advanced artificial intelligence (AI) and machine learning, this complex spectrum is then deconvoluted into individual quantities with capacity for over hundreds of thousands of different peptides per sample. Our facility in Switzerland is of the largest high-end GLP certified and GCP compliant mass spectrometry laboratories worldwide, providing large-scale, high-throughput proteomics services to the scientific community. Thanks to our state-of-the-art instrumentation and automation, we can handle large volumes of samples, while maintaining our unprecedented precision and depth. We deliver projects with a fast turnaround time and routinely perform studies with over 1,000 samples for global pharma and biotech customers, academic institutions, and research consortia. We’ve now consolidated our knowledge and expertise into three large-scale proteomics service platforms - TrueDiscovery™, TrueTarget™, and TrueSignature™— spanning the entire drug development journey from target identification and validation through to preclinical studies and large-scale trials.

ITALIANO

INTRODUZIONE

Lo sviluppo del sequenziamento del DNA di nuova generazione ha trasformato la nostra comprensione della genomica, offrendo una visione senza precedenti della variazione del genoma umano attraverso la salute e la malattia. Ma mentre queste tecnologie sono utili, non possono fornire il quadro completo di ciò che sta accadendo all'interno di cellule, tessuti e organismi. Per questo, dobbiamo guardare all'output finale del genoma: il proteoma. Dopo molti anni all'ombra della genomica, la proteomica è ora pronta per entrare sotto i riflettori. In Biognosys, le nostre piattaforme proteomiche di spettrometria di massa ci consentono di studiare l'espressione, la funzione, la struttura e le modifiche post-traduzionali delle proteine come mai prima d'ora, aprendo un nuovo regno di informazioni e approfondimenti biologici.  Ti illustreremo gli ultimi sviluppi nella proteomica della spettrometria di massa. Inizieremo con i fondamenti della proteomica della spettrometria di massa e i suoi vantaggi per offrire approfondimenti più approfonditi e attuabili che vanno oltre la genomica, la trascrittomica ed altri metodi di proteomica. Tratteremo anche i recenti progressi nella proteomica, comprese le nuove pietre miliari in profondità, copertura e produttività e gli sviluppi nel software analitico guidati da Biognosys. C'è molto altro da esplorare alle frontiere della proteomica: è ora di entrare nella dimensione successiva.

APPROFONDIMENTI DELLA PROTEOMICA TRASFORMATIVA DALLA SCOPERTA ALLA CLINICA

  In Biognosys, crediamo di poter migliorare notevolmente la salute umana decifrando la complessità biologica delle malattie. Fornendo l'accesso al proteoma a tutti i livelli, consentiamo ai ricercatori di scienze della vita ed ai cacciatori di farmaci di sbloccare vere scoperte. Spingiamo i confini di ciò che è possibile con le nostre soluzioni di proteomica per aiutare ad inaugurare una nuova era di bioingegneria e medicina di precisione.

PROTEOMICA: I FONDAMENTALI

CHE COS'È LA PROTEOMICA?

Le proteine sono le biomolecole più complesse esistenti. La loro sbalorditiva diversità strutturale e le modifiche post-traduzionali consentono loro di svolgere un'ampia gamma di funzioni. Una profonda comprensione del proteoma è quindi la chiave per comprendere la biologia, la salute ed i percorsi delle malattie ed è uno strumento vitale nella ricerca di terapie e persino cure più efficaci.

Comprensione del proteoma

Un proteoma è l'insieme delle proteine prodotte da un sistema vivente. È analogo al genoma come l'insieme completo dei geni di un organismo. Tuttavia, i proteomi sono soggetti a modifiche in risposta a vari fattori interni ed esterni, a differenza dei genomi che sono più stabili. La proteomica si concentra sullo studio dell'intero insieme di proteine espresse da un organismo, tessuto o cellula in un particolare momento. Consente la caratterizzazione dell'espressione, della funzione e della struttura delle proteine, ognuna delle quali è la chiave per interpretare completamente i cicli di vita delle proteine e l'interazione. Lievi modifiche al proteoma possono avere un impatto drammatico sullo stato di un sistema vivente. L'utilizzo della proteomica per quantificare migliaia di proteine alla volta ci consente di identificare percorsi aberranti, di caratterizzare l'azione di nuovi composti o di scoprire nuovi biomarcatori per la ricerca clinica.

COS'È LA PROTEOMICA DELLA SPETTROMETRIA DI MASSA?

La proteomica basata sulla spettrometria di massa (MS) è in grado di identificare e quantificare a livello di peptide migliaia di proteine contemporaneamente ad alta velocità e precisione. La SM non solo ci consente di quantificare l'espressione differenziale dell'intero proteoma, ma anche di comprendere le modifiche post-traduzionali delle proteine, le interazioni proteina-proteina e persino i cambiamenti strutturali del proteoma.

Che cos'è la proteomica della spettrometria di massa?

La SM è uno dei pilastri della proteomica. I progressi tecnici nel campo come l'analisi dei dati, la strumentazione ed i miglioramenti generali del flusso di lavoro hanno consentito una maggiore profondità, robustezza, riproducibilità e scalabilità nella proteomica, consentendo ai ricercatori di identificare e quantificare le proteine su scala proteomica. La proteomica basata su MS include una collezione in espansione di tecnologie che consentono la caratterizzazione e la quantificazione ad alto rendimento delle proteine in un sistema biologico. Mentre la sequenza del genoma fornisce un'istantanea dettagliata della complessità biologica di un organismo, l'attività che si verifica a livello proteico non può essere dedotta dall'analisi genomica o addirittura trascrittomica. Pertanto, un approccio proteomico può essere utilizzato in combinazione o al posto di altre tecnologie "omiche" per colmare il divario tra genotipo e fenotipo e fornire l'approccio più completo per la profilazione delle proteine, comprese le loro interazioni e modifiche.

Come funziona la proteomica della spettrometria di massa?

  Il metodo di spettrometria di massa più comune per lo studio delle proteine è descritto come proteomica "dal basso verso l'alto", che inizia scindendo una miscela di proteine in peptidi. Questa miscela viene separata tramite cromatografia liquida prima di essere ionizzata e analizzata nello spettrometro di massa.

Gli spettrometri di massa comprendono tre componenti principali: una sorgente di ioni, un analizzatore di massa ed un rivelatore. Utilizzando un'alta tensione, i peptidi in fase liquida vengono convertiti in ioni gassosi che vengono immessi nell'analizzatore di massa, dove vengono separati dai loro rapporti massa-carica (m/z). Un rilevatore elettrico registra ciò che è noto come pattern spettrale, che rappresenta il numero di ioni per m/z. Questo spettro può essere interpretato per identificare le molecole che compongono le proteine nel campione originale. Nel contesto della proteomica, la spettrometria di massa è uno strumento prezioso in quanto consente una specificità senza precedenti e profondità di quantificazione eccezionali. Inoltre, la spettrometria di massa in tandem, in cui più analizzatori sono accoppiati insieme per massimizzare il numero di peptidi identificati in miscele complesse, può fornire informazioni squisitamente dettagliate sulle sequenze di amminoacidi.

PROTEOMICA DI SPETTROMETRIA DI MASSA A CONFRONTO CON ALTRI APPROCCI

Attualmente, due classi di tecnologie di proteomica sono ampiamente utilizzate negli studi ad alto rendimento: spettrometria di massa e proteomica basata sull'affinità. Qui, spieghiamo come funziona ogni tecnica ed i loro vantaggi e svantaggi.

Proteomica basata sull'affinità

  Le tecniche di proteomica di affinità si basano sull'uso di molecole come aptameri o anticorpi, che si legano specificamente a domini proteici noti, per il rilevamento e la quantificazione del bersaglio. Questi strumenti in genere risolvono il problema di un'ampia gamma di concentrazioni proteiche utilizzando più fasi di diluizione del campione e amplificazione del segnale. Sebbene sia spesso possibile un'elevata specificità, le tecniche basate sull'affinità si basano sulla disponibilità e sull'accessibilità vincolante di anticorpi o aptameri per domini proteici noti. Pertanto, non possono scoprire molecole nuove o inaspettate e possono perdere modifiche o isoforme post-traduzionali vitali. Inoltre, quando si utilizza un'azienda di proteomica che utilizza una tecnica basata sull'affinità, in genere non condivide i dati completi od i dettagli analitici, ad esempio quali anticorpi vengono utilizzati.

Proteomica della spettrometria di massa

Gli approcci di proteomica della spettrometria di massa identificano e quantificano direttamente i frammenti peptidici nell'intero proteoma dopo la digestione enzimatica. I flussi di lavoro di spettrometria di massa convenzionali utilizzano l'acquisizione dipendente dai dati (DDA) per rilevare e quantificare le proteine note, con conseguente identificazione e quantificazione parziale dei peptidi ed una sottorappresentazione delle molecole a bassa abbondanza. Al contrario, Biognosys ha aperto la strada all'uso dell'acquisizione indipendente dai dati (DIA), che rileva e quantifica tutte le proteine all'interno di un campione. Ciò fornisce un approccio imparziale per la proteomica della scoperta, che non è possibile con la spettrometria di massa DDA o le tecniche basate sull'affinità.

La spettrometria di massa DIA può anche fornire informazioni strutturali sulla conformazione proteica ed identificare modifiche post-traduzionali, nessuna delle quali può essere rilevata con metodi basati sull'affinità. Di conseguenza, la spettrometria di massa può esplorare e testare diverse ipotesi e rivelare una biologia più complessa rispetto alle tecniche basate sull'affinità, spingendo avanti la vera scoperta. Il nostro flusso di lavoro di deplezione del plasma supera anche il problema di un'ampia gamma dinamica di concentrazioni proteiche nel sangue, rimuovendo molte delle proteine ​​più abbondanti per consentire una quantificazione profonda delle proteine ​​a bassa abbondanza. Il nostro metodo di esaurimento è automatizzato e standardizzato per garantire un'elevata sensibilità e riproducibilità su migliaia di campioni e più punti temporali.

L'APPROCCIO BIOGNOSYS ALLA PROTEOMICA DELLA SPETTROMETRIA DI MASSA

In Biognosys, abbiamo sviluppato metodi di nuova generazione per misurare le proteine su questa scala proteomica. Distribuiamo spettrometria di massa potenziata con acquisizione dati parallela di segnali peptidici per la copertura più profonda possibile di proteomi completi. Utilizzando un software proprietario per l'identificazione delle proteine e strumenti di quantificazione basati su intelligenza artificiale avanzata (AI) e apprendimento automatico, questo spettro complesso viene quindi deconvoluto in singole quantità con capacità per oltre centinaia di migliaia di peptidi diversi per campione. La nostra struttura in Svizzera è uno dei più grandi laboratori di spettrometria di massa di fascia alta certificati GLP e conformi a GCP in tutto il mondo, che fornisce servizi di proteomica su larga scala e ad alto rendimento alla comunità scientifica. Grazie alla nostra strumentazione e automazione all'avanguardia, siamo in grado di gestire grandi volumi di campioni, pur mantenendo la nostra precisione e profondità senza precedenti. Consegniamo progetti con tempi di consegna rapidi ed eseguiamo regolarmente studi con oltre 1.000 campioni per clienti farmaceutici e biotecnologici globali, istituzioni accademiche e consorzi di ricerca. Ora abbiamo consolidato le nostre conoscenze e competenze in tre piattaforme di servizi di proteomica su larga scala, TrueDiscovery™, TrueTarget™ e TrueSignature™, che coprono l'intero percorso di sviluppo del farmaco, dall'identificazione e convalida del target fino agli studi preclinici e alle sperimentazioni su larga scala.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Biognosys/March%202023/E-book_Issue%201_2023-02.pdf