Taming T4: i vettori virali artificiali forniscono grandi carichi utili nelle cellule umane / Taming T4: Artificial Viral Vectors Deliver Big Payloads into Human Cells
Taming T4: i vettori virali artificiali forniscono
grandi carichi utili nelle cellule umane / Taming
T4: Artificial Viral Vectors Deliver Big Payloads
into Human Cells
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported
by Dr. Giuseppe Cotellessa
Questi nanoshell programmabili possono
confezionare simultaneamente più di 100 kb di
DNA, molti tipi di RNA ed un'ampia varietà di
proteine per il rimodellamento del genoma umano
Venigalla B. Rao, PhD, studia i batteriofagi da più di quattro decenni, principalmente in piccoli laboratori con personale e finanziamenti limitati. Ma avere un laboratorio di sole otto persone (quattro dottori di ricerca, due studenti laureati e due tecnici di ricerca) non ha impedito a Rao di perseguire il suo obiettivo di utilizzare i fagi per trasformare le terapie geniche e la medicina personalizzata.
In un nuovo studio pubblicato su Nature Communications, Rao ed il suo gruppo mostrano come costruire vettori virali artificiali (AVV) utilizzando una tecnica di catena di montaggio che consente la consegna di grandi carichi utili biomolecolari, come 171 kilobasi di DNA, migliaia di molecole proteiche e RNA. Per modificare il genoma umano - ricombinare o sostituire i geni, alterare o silenziare l'espressione genica - hanno ridisegnato i componenti strutturali ben caratterizzati del batteriofago T4 per svolgere questi compiti.
Per programmare e fornire biomolecole terapeutiche, Rao e colleghi hanno utilizzato i batteriofagi T4 per costruire AVV con un grande volume interno ed un'ampia superficie esterna. Gli esperimenti proof-of-concept hanno mostrato la fattibilità di questi AVV per l'uso nell'ingegneria del genoma caricandoli con un carico di proteine e acidi nucleici. Il gene della distrofina a lunghezza intera ed altre operazioni molecolari per modificare il genoma umano sono state eseguite con successo in laboratorio utilizzando la piattaforma. Gli AVV hanno un alto rendimento ed un basso costo di produzione, ed i nanomateriali hanno dimostrato di essere stabili per diversi mesi.
Rao spera che questa tecnica possa eventualmente essere utilizzata per trattare una varietà di disturbi comuni e rari negli esseri umani, sebbene siano necessari ulteriori studi per determinarne la sicurezza.
Il sussurratore di fagi
Dopo aver terminato la sua tesi sull'ingegneria degli enzimi presso l'Indian Institute of Science, Rao ha iniziato il suo lavoro post-dottorato sui fagi nel laboratorio del defunto Lindsay W. Black presso la University of Maryland School of Medicine. Come ha spiegato Rao a GEN , "quando abbiamo iniziato, si sapeva molto poco sulla confezione del DNA: era una grande e misteriosa scatola nera".
Nel 1989, Rao è entrato a far parte della facoltà della Catholic University of America a Washington DC, dove ha istituito il proprio programma di ricerca. A volte Rao ammette di aver lottato perché è una ricerca molto basilare ed i fagi non sono gli organismi più popolari con cui lavorare.
"Né NSF né NIH erano veramente interessati a finanziare la ricerca sui fagi con tanto entusiasmo", ha detto Rao. “Ma ho sempre creduto nei fagi perché questi sono buoni sistemi modello per comprendere veramente i meccanismi di base del confezionamento del DNA, c'è molto che possiamo manipolare geneticamente e sono poco costosi. Posso farlo con gli studenti ed un piccolo laboratorio di ricerca con piastre di Petri e terreni LB”.
Rao ha insistito ed alla fine i suoi sforzi sono stati finanziati dalla National Science Foundation. Poi, nel 1999, Michael Rossmann, PhD della Purdue University, che era diventato famoso per la sua analisi cristallografica a raggi X del comune virus del raffreddore, venne a sapere di alcuni intriganti mutanti di imballaggio in fase di sviluppo nel laboratorio di Rao. Lavorando insieme, Rossman e Rao sono diventati una forza trainante nella decifrazione dei componenti della confezione del DNA del batteriofago.
Domare T4
In questo periodo, Rao si rese conto dell'importanza di applicare questa conoscenza nel campo della medicina. A causa del crescente interesse per lo sviluppo di vaccini di biodifesa in seguito alla paura dell'antrace negli Stati Uniti a partire dal 18 settembre 2001, una settimana dopo gli attacchi terroristici dell'11 settembre, Rao inizialmente si concentrò sui vaccini e su come mostrare molecole di antigene patogeno sul fago superficie del capside, che ha ricevuto finanziamenti decenti.
Parallelamente, Rao ha continuato a scavare nei meccanismi interni dell'imballaggio dei fagi, osservando che il nanoguscio del capside dei fagi potrebbe essere progettato per scopi che vanno oltre i vaccini. "Sentivo che la terapia genica è dove potrebbe avere il maggiore impatto perché il campo della terapia genica ha avuto difficoltà a causa della capacità limitata e della flessibilità ingegneristica dei vettori disponibili", ha affermato Rao.
Rao ha continuato il suo lavoro sull'utilizzo dei fagi come veicolo per la terapia genica nelle cellule umane, come pubblicato in un articolo PNAS con i suoi colleghi nel 2013 . Rao afferma che la tecnologia è stata quasi ottimizzata nel suo laboratorio al punto che molte cose sono possibili con quel nanoguscio. "Possiamo impacchettare più geni e plasmidi nello stesso capside e visualizzare molecole per indirizzare i nanoshell a cellule e tessuti specifici", ha affermato Rao.
Poiché i patogeni umani hanno doppi strati lipidici (a differenza dei fagi), Rao ha pensato che le nanoparticelle dovessero essere rivestite di lipidi per traslocare nelle cellule umane in modo più efficace. Fu sorpreso di scoprire che la superficie dei fagi T4 era naturalmente ricettiva al rivestimento lipidico. Dopo aver sperimentato varie condizioni, è stato in grado di raggiungere questo obiettivo.
Sebbene i fagi siano semplici da lavorare geneticamente, Rao afferma che è ancora un processo noioso generare mutanti. Per generare rapidamente tutti i mutanti di cui avevano bisogno, il gruppo di Rao ha sviluppato la tecnologia ingegneristica CRISPR e ha identificato un nanoguscio mutante che ha portato ad un'efficienza di consegna cinque volte superiore rispetto al capside di tipo selvaggio.
Nell'ultimo lavoro del suo gruppo, Rao dimostra come hanno ottimizzato questa tecnologia nel rapporto Nature Communications, dimostrando la loro capacità di impacchettare enormi quantità di DNA, RNA e proteine, nonché complessi che combinano queste biomolecole, come i sistemi CRISPR con RNA guida .
Mentre il gruppo di Rao ha dimostrato la fattibilità del loro sistema in linee cellulari immortalizzate come 293 cellule T, stanno attualmente lavorando per implementarlo in cellule umane primarie e cellule staminali embrionali umane, e persino in un modello animale in vivo. L'obiettivo, secondo Rao, è inserire il sistema in un modello di topo il prima possibile in modo che possa essere portato in clinica in un futuro non troppo lontano.
Il lavoro precedente del laboratorio di Rao, che è stato pubblicato su bioRxiv circa un anno fa, ha dimostrato la specificità cellulare con il sistema fagico T4, mirando alle cellule T umane primarie CD4+.
Dall'idea alla clinica
Per Rao, invece, le risorse a disposizione (denaro e strutture) sono ancora il collo di bottiglia. "Il mio laboratorio di ricerca è davvero piccolo: ci sono voluti più di sette anni per sviluppare questa tecnologia utilizzando una grande quantità di informazioni di base", ha affermato Rao. “Abbiamo davvero bisogno di finanziamenti per costruire l'infrastruttura necessaria per portarlo in clinica il più rapidamente possibile, soprattutto perché i virus adeno-associati (AAV) e i lentivirus sono già nella clinica. L'industria della biotecnologia è più interessata ad investire in qualcosa che è già nella clinica. Si spera che il documento mostri un livello di entusiasmo per forse correre dei rischi qui. La ricompensa potrebbe essere enorme”.
In effetti, questo non è stato fatto clinicamente con i fagi T4. Ma Rao è certo che, poiché i batteriofagi T4 sono un residente naturale del microbioma intestinale e, sulla base dei dati dei progetti sui vaccini, possono essere molto sicuri per le applicazioni biomediche. "Come parte dei nostri progetti sui vaccini, abbiamo effettuato numerose vaccinazioni intramuscolari ed endovenose in una varietà di animali, compresi i macachi rhesus, e si sono rivelati tutti abbastanza innocui", ha affermato Rao. "Non si è verificato alcun incidente di alcun grave effetto collaterale della somministrazione di quantità piuttosto elevate di batteriofagi T4".
Alla Catholic University, Rao ha affermato che il suo laboratorio ha effettivamente progettato vaccini COVID, incluso un vaccino nasale, che sta cercando di portare sul mercato globale. Rao ha idee per sviluppare un efficiente processo GMP per produrre fagi T4 per applicazioni biomediche e ha affermato che, per quanto ne sa, dovrebbe essere molto più semplice che produrre AAV e lentivirus perché i fagi T4 sono prodotti in E. coli e non richiedono altrettante considerazioni sulla sicurezza (sebbene l'immunogenicità potrebbe essere un problema).
Rao è fiducioso che, a differenza dei tradizionali vettori virali, i fagi T4 abbiano una flessibilità ed una capacità ingegneristica impressionanti. Anche se si aspetta alcune sfide, crede che questo lavoro potrebbe davvero aprire un nuovo spazio per la terapia genica oltre le malattie monogeniche.
"I T4-AVV potrebbero essere utilizzati con malattie più complesse e per farmaci personalizzati perché possiamo più facilmente, utilizzando lo stesso sistema, modificare leggermente la biomolecola per personalizzarla a seconda della mutazione nella malattia genetica", ha affermato Rao. “Penso che sarebbe molto più rapido apportare effettivamente quei cambiamenti e personalizzarli. Ne siamo molto ispirati ed entusiasti. Speriamo di poter accelerare il processo e realizzarlo”.
ENGLISH
These programmable nanoshells can package more than 100 kb DNA, many types of RNAs, and a wide variety of proteins simultaneously for human genome remodeling.
Venigalla B. Rao, PhD, has been studying bacteriophages for more than four decades, mostly in small laboratories with limited personnel and funding. But having a mere eight-person lab (four post-docs, two graduate students, and two research technicians) hasn’t deterred Rao from pursuing his goal of using phages to transform gene therapies and personalized medicine.
In a new study published in Nature Communications, Rao and his team show how to construct artificial viral vectors (AVVs) using an assembly-line technique that allows for the delivery of large biomolecular payloads, such as 171 kilobases of DNA, thousands of protein molecules, and RNAs. In order to edit the human genome—recombine or replace genes, alter or silence gene expression—they have redesigned the well-characterized structural components of bacteriophage T4 to accomplish these tasks.
In order to program and deliver therapeutic biomolecules, Rao and colleagues used T4 bacteriophages to build AVVs with a large internal volume and a large external surface. Proof-of-concept experiments showed the viability of these AVVs for use in genome engineering by loading them with protein and nucleic acid cargo. The full-length dystrophin gene and other molecular operations to modify the human genome were successfully carried out in the lab using the platform. The AVVs have a high yield and low cost of production, and the nanomaterials have been shown to be stable for several months.
Rao hopes that this technique could eventually be used to treat a variety of common and rare disorders in humans, although more study is needed to determine its safety.
The phage whisperer
After finishing his dissertation on enzyme engineering at the Indian Institute of Science, Rao began his postdoctoral work on phages in the lab of the late Lindsay W. Black at the University of Maryland School of Medicine. As Rao explained to GEN, “when we started this, very little was known about DNA packaging—it was a big, mysterious black box.”
In 1989, Rao joined the faculty of the Catholic University of America in Washington D.C., where he established his own research program. At times Rao admits he struggled because it’s very basic research, and phages are not the most popular organisms to work with.
“Neither NSF nor NIH were really interested in funding phage research that enthusiastically,” said Rao. “But I always believed in phages because these are good model systems to really understand the basic mechanisms of DNA packaging, there’s a lot we can manipulate genetically, and they are inexpensive. I can do it with students and a small research lab with Petri dishes and LB media.”
Rao persisted, and his efforts were ultimately funded by the National Science Foundation. Then, in 1999, Purdue University’s Michael Rossmann, PhD, who had become famous for his X-ray crystallographic analysis of the common cold virus, heard about some intriguing packaging mutants being developed in Rao’s lab. Working together, Rossman and Rao became a driving force in deciphering the components of bacteriophage DNA packaging.
Taming T4
Around this time, Rao realized the importance of applying this knowledge in the field of medicine. Because of the rising interest in the development of biodefense vaccines following the anthrax scare in the United States beginning on September 18, 2001, one week after the September 11 terrorist attacks, Rao initially focused on vaccines and how to display pathogen antigen molecules on the phage capsid surface, which received decent funding.
In parallel, Rao kept digging into the inner workings of phage packaging, noting that the capsid nanoshell of phages could be engineered for purposes beyond vaccines. “I felt gene therapy is where it might make the biggest impact because the gene therapy field has been struggling because of the limited capacity and engineering flexibility of the vectors available,” said Rao.
Rao continued his work on using phages as a vehicle for gene therapy in human cells, as published in a PNAS article with his colleagues in 2013. Rao claims that the technology has been nearly optimized in his lab to the point where many things are possible with that nanoshell. “We can package multiple genes and plasmids in the same capsid and display molecules to target the nanoshells to specific cells and tissues,” said Rao.
As human pathogens have lipid bilayers (unlike phages), Rao reasoned that the nanoparticles needed to be coated in lipids in order to translocate into human cells more effectively. He was surprised to discover that the surface of T4 phages was naturally receptive to lipid coating. After experimenting with various conditions, he was able to achieve this.
Although phages are simple to work with genetically, Rao claims that it is still a tedious process to generate mutants. In order to quickly generate any mutants they required, Rao’s team developed CRISPR engineering technology and identified a mutant nanoshell that resulted in five times the delivery efficiency of the wild-type capsid.
In his team’s latest work, Rao demonstrates how they have optimized this technology in the Nature Communications report, demonstrating their ability to package massive amounts of DNA, RNA, and proteins, as well as complexes combining these biomolecules, such as CRISPR systems with guide RNAs.
While Rao’s team has demonstrated the feasibility of their system in immortalized cell lines like 293 T cells, they are currently working to implement it in primary human cells and human embryonic stem cells, and even in an in vivo animal model. The goal, according to Rao, is to get the system into a mouse model as soon as possible so that it can be brought to the clinic in the not-too-distant future.
Previous work from Rao’s lab, which was posted on bioRxiv about a year ago, demonstrated cell-specificity with the T4 phage system, targeting CD4+ primary human T-cells.
From concept to clinic
For Rao, however, the available resources (money and facilities) are still the bottleneck. “My research lab is really small—all this took like seven plus years to develop this technology using a large amount of basic information,” said Rao. “We really need funding to build the infrastructure needed to take it to the clinic as quickly as possible, especially that the adeno-associated viruses (AAVs) and lentiviruses are already in the clinic. The biotechnology industry is more interested in investing in something that’s already in the clinic. Hopefully, the paper will show a level of enthusiasm to maybe take some risks here. The pay-off could be tremendous.”
Indeed, this has not been done clinically with T4 phages. But Rao is certain that since T4 bacteriophages are a natural resident of the gut microbiome, and based on the data from the vaccine projects, they can be very safe for biomedical applications. “As part of our vaccine projects, we have done numerous intramuscular and intravenous immunizations in a variety of animals, including rhesus macaques, and they all turned out to be quite innocuous,” said Rao. “There was no incident of any serious side effect of administering fairly large quantities of T4 bacteriophages.”
At Catholic University, Rao said his lab actually designed COVID vaccines, including a nasal vaccine, which he is trying to bring to global market. Rao has ideas to develop an efficient GMP process to manufacture T4 phages for biomedical applications and said that, as far as he can tell, it should be much simpler than making AAVs and lentiviruses because T4 phages are produced in E. coli and don’t require as many safety considerations (although immunogenicity might be an issue).
Rao is confident that, unlike traditional viral vectors, T4 phages have impressive flexibility and engineering capacity. While he expects some challenges, he believes that this work could really open up a new space for gene therapy beyond monogenic diseases.
“The T4-AVVs could be used with more complex diseases and for personalized medicines because we can more easily, using the same system, slightly change the biomolecule to personalize it depending on the mutation in the genetic disease,” said Rao. “I think it would be much more rapid to actually make those changes and individualize it. We are highly inspired and excited about it. Hopefully, we can accelerate the process and make it happen.”
Da:
https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/taming-t4-artificial-viral-vectors-deliver-big-payloads-into-human-cells/?MailingID=%DEPLOYMENTID%&utm_medium=newsletter&utm_source=GEN+Daily+News+Highlights&utm_content=01&utm_campaign=GEN+Daily+News+Highlights_20230531&oly_enc_id=8653B6936723E0S
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