Evaluation of Complement-Dependent Cytotoxicity (CDC) Using a Streamlined, Miniaturized Advanced Flow Cytometry Assay / Valutazione della citotossicità dipendente dal complemento (CDC) mediante un saggio di citometria a flusso avanzato semplificato e miniaturizzato

Evaluation of Complement-Dependent Cytotoxicity (CDC) Using a Streamlined, Miniaturized Advanced Flow Cytometry Assay / Valutazione della citotossicità dipendente dal complemento (CDC) mediante un saggio di citometria a flusso avanzato semplificato e miniaturizzato

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure  1 Workflow Schematic for the CDC Assay Using High-Throughput Flow Cytometry 

Combine target cells (optionally labeled with iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye to distinguish multiple cell types in a single well) and mAbs of interest in a 96- or 384-well plate. Incubate for 15 min at room temperature (RT) to promote antibody binding to targets. Add human serum and incubate for a further 30–60 min (37 °C). Wash then label with iQue® Cell Membrane Integrity Dye (choice of V/Blue, B/Green, B/Red, R/Red) for 30 min (RT) and collect data using the iQue® Advanced Flow Cytometer. / Schema del flusso di lavoro per il saggio CDC utilizzando la citometria a flusso ad alta produttività

Combinare le cellule bersaglio (etichettate facoltativamente con iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye per distinguere più tipi di cellule in un singolo pozzetto) e mAb di interesse in una piastra da 96 o 384 pozzetti. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) per promuovere il legame degli anticorpi agli obiettivi. Aggiungere il siero umano e incubare per altri 30-60 min (37 °C). Lavare quindi etichettare con iQue® Cell Membrane Integrity Dye (scelta di V/Blue, B/Green, B/Red, R/Red) per 30 min (RT) e raccogliere dati utilizzando iQue® Advanced Flow Cytometer.

Introduction

Research and development of monoclonal antibody (mAb) therapeutics is a vast and expanding area of drug discovery, largely due to mAb potential for high specificity and affinity towards target molecules. The past decade has seen a stark increase in the number of approvals for mAb therapeutics, with 11 molecules granted first approval in the US or EU in 2021. Approved mAb-based therapeutics span a wide range of disease areas, although most are indicated for treatment of cancers (45%), such as anti-CD20 treatment of B-cell cancers, or for immune-mediated disorders (27%), such as antiTNF treatment of inflammatory diseases. There are several mechanisms of action (MoAs) through which mAbs are cytotoxic towards target cells, such as cancer cells. These MoAs often harness the power of the body’s own immune system to exert anti-tumor effects. Examples of this include the three key Fc-mediated functions: antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), and complement-dependent cytotoxicity (CDC). ADCC and ADCP rely on a mAb simultaneously engaging with Fc receptors on immune cells and the antigen on target cells. This brings the target cells into proximity with cytotoxic cells (e.g., natural killer cells) or phagocytic cells (e.g., monocytes or macrophages), leading to enhanced immune clearance. Contrastingly, in CDC, the antigen-bound mAb recruits proteins present in the blood to induce lysis. This process begins with binding of the C1q protein to the mAb Fc region, which triggers activation of the complement pathway. A complex molecular cascade follows, which eventuates in the formation of the membrane attack complex (MAC). The MAC creates a pore in the target cell membrane, resulting in cell death. During early stage mAb development, in vitro assays are often used to profile activity towards several MoAs, including CDC, to ensure mAbs with desirable characteristics are selected for clinical evaluation. Conventional techniques for measuring CDC activity often: 

ƒ Require large volumes of precious antibody and serum samples 

ƒ Use instrumentation with low-throughput acquisition (e.g., traditional flow cytometry) 

ƒ Are laborious and time-consuming, requiring steps such as protocol optimization, fixation, and multiple washes 

In this application note, we present a streamlined, miniaturized workflow for quantifying mAb-induction of CDC activity using the iQue® Advanced Flow Cytometry Platform. Combining the high-throughput and low sample volume requirements of the iQue® with rapid data analysis using the integrated iQue Forecyt® software has the potential to simplify and speed up antibody characterization and drug discovery processes.

Methods 

Assay Concept 

Target cells of interest are seeded into 96- or 384-well V-bottom plates. The iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye can be used to label the target cells so that multiple cell types can be distinguished in a single well (for example a bright, mid-bright, dim, and unstained population). This assay is appropriate for use with both suspension and adherent target cells. Test mAbs are added to cells before human serum is added to induce CDC. Cells are then washed and labeled using the iQue® Cell Membrane Integrity (R/Red) Dye to enable quantification of cell death. Fluorophore-conjugated antibodies may be included at this stage if cell surface marker expression is desired. Following a final wash step, cells are resuspended and run on the iQue® Advanced Flow Cytometry Platform. In the integrated iQue Forecyt® software, a simple gating strategy is applied to determine the proportion of dead cells per well.

Assay Workflow 1.

 Optional: If adding multiple cell types per well, distinguish cells by labeling with iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye: 

1.1 Prepare a working stock of encoder dye by diluting in phosphate-buffered saline (PBS) (e.g., dilution factor, 1 in 1000 for bright staining). Note: If using more than two cell types per well, the bright dye can be diluted (e.g., 1 in 10) to create dimmer populations. 

1.2 Collect cells in a conical tube, wash in PBS, and resuspend at 2 x 106 cells/mL. 

1.3 Add an equal volume of the prepared dye solution (1:1) and incubate (37 °C, 15 min). 

1.4 Wash cells with at least 2X volume of cell culture media (including 10% serum) and spin (500 g, 5 min). 

1.5 Repeat wash step twice more. 

2. Prepare target cells to an appropriate density in serum-free cell culture media and seed 10 µL/well in a V-bottom 96- or 384-well plate (e.g., Corning 3363 or 3656). Note: Recommend a starting cell density of approximately 5–10 K/well for each cell type. 

3. Add 10 µL of test mAbs (prepared in serum-free media) and incubate for 15 min at room temperature.

4. Add 10 μL of human serum prepared at 3X final assay concentration (FAC) and diluted in serum-free media (e.g., 45% to give a FAC of 15%), and incubate for 30–60 min at 37 °C. Note: Recommended controls include serum-free media alone (i.e., no serum) and/or 15% heat inactivated serum (56 °C, 30 min). 

5. Add 100 µL of wash buffer (e.g., PBS + 2% FBS) and centrifuge (300 g, 5 min). 

6. Remove media and shake (2000 RPM, 1 min) using the iQue® plate shaker to resuspend cells. 

7. Add 10 µL iQue® Cell Membrane Integrity Dye (choice of V/Blue, B/Green, B/Red, R/Red) using concentration recommended in dye protocol and incubate for 30 min at room temperature. Optional: Fluorophore-conjugated antibodies can be added at this stage to simultaneously measure marker expression. 

8. Wash, spin, and resuspend as in steps 5 and 6. Add 20 µL/well wash buffer. 

9. Run on the iQue® using a 3–5 seconds sip time and analyze data using iQue Forecyt® software, applying a simple gating template (Figure 2).

Figure 2 Gating Strategy for Quantifying Cell Death in the iQue® CDC Assay First, cells and single cells are gated. If multiple cell types were included in the well, they can then be separated based on fluorescence of the iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye. Cell viability can then be determined based on iQue® Cell Membrane Integrity (R/Red) Dye staining. / 

Strategia di gating per quantificare la morte cellulare nel test iQue® CDC In primo luogo, le cellule e le singole cellule vengono gated. Se nel pozzetto sono stati inclusi più tipi di cellule, è possibile separarli in base alla fluorescenza del colorante iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue). La vitalità cellulare può quindi essere determinata in base alla colorazione iQue® Cell Membrane Integrity (R/Red) Dye.

Results

Serum Donor and Concentration May Impact Levels of CDC 

We have previously shown that the donor from which immune cells are acquired for an ADCC or ADCP assay can have a large impact on the level of the induced antibodymediated killing mechanism. To explore whether this effect also applied to CDC, we looked at the level of CDC in the presence of a range of concentrations of Rituximab (anti-CD20-IgG1) with four different donors as the source of human serum (Figure 3A and B). High-CD20-expressing Ramos cells from a B-lymphocyte line were used as target cells. Overall, the levels of CDC induced by Rituximab in the presence of each of the four donors was similar, particularly for donors 1, 2, and 3, between which EC50 values for the CDC response ranged from 0.29–0.36 µg/ mL. The EC50 for CDC in the presence of donor 4 serum was slightly outside of these values at 0.53 µg/mL. These data highlight that if performing antibody screening for CDC activity, it may be worth testing activity with several different donors to ensure similar trends are observed. However, based on our observations, fluctuations due to the serum donor are likely minimal and perhaps less critical than in an ADCC or ADCP assay (data not shown).

 Figure 3 Minimal Impact of Serum Donor and Concentration on CDC by Rituximab (A) Ramos cells were seeded in 96-well plates and incubated with Rituximab (anti-CD20-IgG1) and human serum from four different donors or with no serum. (B) Summary of EC50 values from the data in (A). (C) Ramos cells were seeded in a 384-well plate alongside Rituximab and a range of concentrations of serum from a single donor. No serum or heat-inactivated serum were included as controls. (D) EC50 values from curves in (C). CDC was quantified by measuring the decrease in percentage of live Ramos cells through labelling with the iQue® Cell Membrane Integrity (R/Red) Dye. / Impatto minimo del donatore di siero e concentrazione su CDC da parte di Rituximab (A) Le cellule Ramos sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e incubate con Rituximab (anti-CD20-IgG1) e siero umano di quattro diversi donatori o senza siero. (B) Riepilogo dei valori EC50 dai dati in (A). (C) Le cellule Ramos sono state seminate in una piastra a 384 pozzetti insieme a Rituximab e una gamma di concentrazioni di siero da un singolo donatore. Nessun siero o siero inattivato dal calore è stato incluso come controllo. (D) Valori EC50 dalle curve in (C). Il CDC è stato quantificato misurando la diminuzione della percentuale di cellule Ramos vive attraverso l'etichettatura con il colorante iQue® Cell Membrane Integrity (R/Red).

The assay optimization process included measurement of how the level of CDC differed with the concentration of human serum added. Figure 3C shows the CDC activity of Rituximab, measured with three different concentrations of serum from the same donor. The EC50values in Figure 3D show a general increase in activity with increasing serum concentration. To get the balance between maximizing CDC response while minimizing usage of both serum and antibody samples we concluded to move ahead with a serum concentration of 15% for subsequent assays. Levels of CD20 Expression on Target Cells Correlated with CDC Activity Several studies have shown links between CD20 expression on cancerous target cells and the level of CDC activity exerted on them by anti-CD20 antibodies. Subsequent experiments aimed to explore differences in CDC between suspension cell types using the iQue® assay. The histogram   in Figure 4A shows the relative cell surface CD20 expression on three cancer cell lines: Ramos, Rajis (another B-lymphocyte cell line) and Jurkats (a T-lymphocyte cell line). These data show that CD20 expression is highest on Ramos cells, with a median fluorescence intensity (MFI) x 106 of 3.08 ± 0.1, compared to 1.51 ± 0.03 on Raji cells. Expression of CD20 on Jurkat cells was similar to the IgG background control, with an MFI x 106 of 0.06 ± 0.0005. To conserve time and reagents, iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye was used to differentially label cells to enable them to be distinguished within a single well, allowing comparison of CDC across multiple antibodies, concentrations, and cell types using a single 384- well plate. The histogram in Figure 4B shows how the cell types were separated, with the Rajis brightly labeled, Ramos more dimly labeled, and Jurkats unlabeled.

Figure 4 Higher CD20 Expression Elicits Greater CDC Induction by Anti-CD20 mAbs (A) Relative CD20 expression on Jurkat, Raji, and Ramos cells compared to an IgG background control. (B) 5K/well of each cell type were seeded in a 384-well plate for a CDC assay and separated using differential labeling with iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye. CDC activity was measured with a range of concentrations of (C) Rituximab and (D) Truxima® (a Rituximab biosimilar). / Una maggiore espressione di CD20 suscita una maggiore induzione di CDC da parte di mAb anti-CD20 (A) Espressione relativa di CD20 su cellule Jurkat, Raji e Ramos rispetto a un controllo di fondo IgG. (B) 5K/pozzetto di ciascun tipo cellulare sono stati seminati in una piastra a 384 pozzetti per un test CDC e separati utilizzando l'etichettatura differenziale con iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye. L'attività del CDC è stata misurata con un intervallo di concentrazioni di (C) Rituximab e (D) Truxima® (un biosimilare di Rituximab).

Figures 4C and 4D reveal how CDC induction by both Rituximab and Truxima® differed depending on the target cell type. The high-CD20-expressing Ramos cells saw the greatest percentage cell death at the highest concentrations of both mAbs, with a 68 and 70% reduction in live cells compared to the IgG control for Rituximab and Truxima®, respectively. The mid-CD20-expressing Raji cells saw considerably less CD20 mAb induction of CDC compared to the Ramos, at 34% (Rituximab) and 24% (Truxima®). As expected, no CDC was induced in the presence of CD20-negative Jurkat cells.

Multiplexed Measurement of Complement Protein Binding and CDC Activity To delve deeper into the CDC mechanism, it can be useful to combine quantification of CDC activity with measurement of expression of cell surface markers or binding of proteins, for example those involved in the formation of the complement complex. The data in Figure 5 show the results from a CDC assay in which a FITC-labeled antibody was included during the labeling step to look at the binding of complement proteins C4c and C4b. C4b binds cells during the complement cascade and is processed to C4c, which remains bound to the cell surface.8 The cell surface location and lack of occlusion of these complement proteins makes them an ideal target for binding  antibodies. This method did not work for measuring binding of the C1q protein (data not shown). This is likely due to recruitment of other proteins to C1q in the complex obstructing antibody binding. Instead, its binding should be measured using purified C1q protein, a method which has been utilized in other studies.9 The results in Figure 5 show that both CDC and C4c and C4b binding increased in response to increasing Rituximab concentrations on the high-CD20-expressing Ramos cells. The EC50value for CDC activity was 0.17 µg/mL while the EC50for C4c and C4b binding was 0.64 µg/mL. No CDC or C4c and C4b binding was observed with either the IgG control antibody or with the antigen-negative Jurkat cell line.

Figure 5 Binding of Complement Proteins C4c and C4b to the Cell Surface Increased with CDC 10K/well each of Ramos and Jurkat cells were seeded with a range of concentrations of Rituximab or an IgG control antibody. Human serum was added for 30 min to induce CDC. (A) Quantification of the percentage of live cells to give an indication of cell death due to CDC activity. (B) MFI on cells for binding of an anti-C4c + C4b antibody (part of the complement protein cascade). / Legame delle proteine del complemento C4c e C4b alla superficie cellulare aumentato con CDC 10K/pozzetto ciascuna delle cellule Ramos e Jurkat è stata seminata con un intervallo di concentrazioni di Rituximab o un anticorpo di controllo IgG. Il siero umano è stato aggiunto per 30 minuti per indurre CDC. (A) Quantificazione della percentuale di cellule vive per dare un'indicazione della morte cellulare dovuta all'attività del CDC. (B) MFI sulle cellule per il legame di un anticorpo anti-C4c + C4b (parte della cascata proteica del complemento).

Induction of Fc Receptor Mechanisms Is Dependent on Antibody Isotype

Many recent drug development efforts have been aimed at producing the next generation of antibody therapeutics with modifications to improve characteristics such as efficacy and stability compared to native antibodies. Examples of these next generation therapeutics include bispecific antibodies, ADCs, nanobodies, and engineered antibodies. Antibodies can be engineered via mutations to the Fc region which can improve function by changing the binding affinity to molecules such as Fc receptors and/or C1q proteins—both of which impact Fc mediated function. Here we used the iQue® to compare Fc functions of an anti-CD20-IgG1 Rituximab-based antibody with two Fc mutants: an IgG1fut (non-fucosylated) and IgG1NQ (nonglycosylated) (Figure 6). The CDC assay was used for this comparison alongside an ADCP assay, which utilized the    iQue® Human ADCP Kit. This kit measures the level of colocalization between phagocytic immune cells, such as monocytes and macrophages, and target cells to give a read-out for the level of ADCP induced by a test mAb. The IgG1NQ mutant showed similar CDC activity to the IgG1 antibody, with a lower maximal death response of 50% ± 2% compared to 66% ± 4% with the native antibody. Contrastingly, its ADCP activity was completely abolished, with a response similar to the IgG control. This is likely because antibody glycosylation is essential for Fc-receptor mediated effector functions. The primary function of the mutation to the IgG-Fc to remove the fucose residue is to enhance ADCC activity and aside from this, its effector function should be similar to the non-mutated IgG1. This is again in line with what we measured in Figure 6 with the IgG1fut mutant inducing comparable, but slightly reduced, CDC and ADCP activity compared to the native antibody 

Figure 6 CDC and ADCP Responses Differ between Anti-CD20 mAb Isotype Fc Mutants (A) Heat map from a CDC assay in which Ramos cells were seeded at 5K/well alongside several anti-CD20-IgG1 antibodies, including IgG1 and two IgG1 isotype mutants: IgG1NQ (non-glycosylated) and IgG1fut (non-fucosylated). βGal-IgG1 antibody was included as a control. CDC was induced by addition of human serum. Darker grey indicates more cell death. (B) Data from (A) shown as concentration response curves for percentage of dead Ramos cells due to CDC. (C) The IgG1 isotypes were also tested for their ADCP activity using the iQue® Human ADCP Kit which measures co-localization between phagocytic immune cells and target cells to indicate ADCP. Ramos cells (2.5K/well) labeled with iQue® Cell Proliferation and Encoding (B/Green) Dye were seeded with PBMCs (20:1 E:T) in a 384-well plate alongside antibodies prior to labeling with the components of the ADCP kit. Analysis was performed using the iQue®. (D) Data from (B) and (C) summarized as a table. / Le risposte CDC e ADCP differiscono tra i mutanti dell'isotipo Fc anti-CD20 mAb (A) Mappa termica da un test CDC in cui le cellule Ramos sono state seminate a 5 K/pozzetto insieme a diversi anticorpi anti-CD20-IgG1, tra cui IgG1 e due mutanti dell'isotipo IgG1: IgG1NQ (non glicosilata) e IgG1fut (non fucosilata). L'anticorpo βGal-IgG1 è stato incluso come controllo. CDC è stato indotto dall'aggiunta di siero umano. Il grigio più scuro indica più morte cellulare. (B) Dati da (A) mostrati come curve di risposta alla concentrazione per la percentuale di cellule Ramos morte dovute a CDC. (C) Gli isotipi IgG1 sono stati anche testati per la loro attività ADCP utilizzando il kit iQue® Human ADCP che misura la co-localizzazione tra le cellule immunitarie fagocitiche e le cellule bersaglio per indicare l'ADCP. Le cellule Ramos (2,5K/pozzetto) marcate con iQue® Cell Proliferation and Encoding (B/Green) Dye sono state seminate con PBMC (20:1 E:T) in una piastra a 384 pozzetti accanto agli anticorpi prima dell'etichettatura con i componenti del Kit ADCP. L'analisi è stata eseguita utilizzando iQue®. (D) Dati da (B) e (C) riassunti in una tabella.

Adherent Cells are Highly Resistant to CDC

It has been estimated that approximately 90% of adult cancers are solid tumors formed from adherent cell types. It is therefore crucial when we are developing in vitro models that we aim to make them suitable for assessment of antibody anti-tumor activity against both suspension and adherent cells. To this end, as well as using the iQue® CDC assay to measure anti-CD20 mAb-induced CDC of B cells, we also wanted to measure anti-HER2 antibody activity against cells from solid tumors, specifically breast cancer cell lines. Figure 7D shows there was no impact on the percentage of live cells when two adherent cell types (high-HER2- expressing AU565 cells and HER2-negative MDA-MB-468 cells) were incubated with a single, high concentration (30 µg/mL) of anti-HER2 antibodies and human serum. This exact same assay setup induced high levels of death of the antigen-positive cell type in the suspension cell model with all three anti-CD20 antibodies, as is evidenced in Figure 7B, with a 53, 57, and 59% reduction in viability compared to the IgG control.    The lack of CDC activity exerted by the anti-HER2 antibodies to the adherent cells is in line with literature sources, of which a number have shown little or no CDC activity by Trastuzumab. These studies suggest that resistance may be conveyed due to overexpression of complement regulatory proteins on the surface of cancer cells. Complement regulatory proteins CD46, CD55, and CD59 are expressed on normal tissues to inhibit complement activity, but their overexpression on the surface of some tumors is linked to inhibition of CDC activity.

Figure 7 Adherent Cells Express Higher Levels of Complement Regulators and Are Resistant to CDC by Anti-HER2 mAbs (A) Dot plot showing separation of antigen-negative Jurkat cells (labeled with iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye) and antigenpositive Ramos cells (unlabeled) enabling assessment of CDC of both cell types simultaneously in each assay well. (B) Cells were incubated with 30 µg/mL of three different anti-CD20-IgG1 antibodies: Rituximab, Truxima® and a non-therapeutic mAb based on Rituximab. CDC was induced by addition of human serum. (C) Plot showing separation of HER2-antigen-negative MDA-MB-468 cells labeled with encoder dye and HER2- antigen-positive AU565 cells (unlabeled). (D) Adherent cells were incubated with human serum and three different anti-HER2-IgG1 antibodies: Trastuzumab, Kadcyla® (an antibody-drug conjugate based on Trastuzumab) and Pertuzumab. A range of suspension and adherent cell types were profiled for their expression of complement regulatory proteins: (E) CD46, (F) CD55, and (G) CD59. / Le cellule aderenti esprimono livelli più elevati di regolatori del complemento e sono resistenti al CDC mediante mAb anti-HER2 (A) Grafico a punti che mostra la separazione delle cellule Jurkat antigene-negative (etichettate con iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye) e Ramos antigene-positivo cellule (senza etichetta) che consentono la valutazione simultanea di CDC di entrambi i tipi di cellule in ciascun pozzetto di analisi. (B) Le cellule sono state incubate con 30 µg/mL di tre diversi anticorpi anti-CD20-IgG1: Rituximab, Truxima® e un mAb non terapeutico basato su Rituximab. CDC è stato indotto dall'aggiunta di siero umano. (C) Grafico che mostra la separazione delle cellule MDA-MB-468 negative all'antigene HER2 etichettate con colorante codificatore e cellule AU565 positive all'antigene HER2 (senza etichetta). (D) Le cellule aderenti sono state incubate con siero umano e tre diversi anticorpi anti-HER2-IgG1: Trastuzumab, Kadcyla® (un coniugato anticorpo-farmaco basato su Trastuzumab) e Pertuzumab. Una gamma di tipi di cellule in sospensione e aderenti è stata profilata per la loro espressione di proteine regolatrici del complemento: (E) CD46, (F) CD55 e (G) CD59.

Figures 7E–G show the results from profiling experiments we carried out to compare the relative expression of complement regulatory markers on five cell lines: two suspension cell types (Ramos and Jurkats) and three adherent cell types (AU565s, BT474s, and MDA-MB-468s). As expected, we saw a general trend towards higher expression of the complement regulatory proteins on adherent cells with lower expression on suspension cells, supporting the hypothesis that this may be the reason for adherent cell resistance to CDC. Following confirmation that adherent cells express higher levels of complement regulatory proteins, we attempted to inhibit these proteins to enhance CDC (data not shown). Wang et al. (2017) reported enhanced Trastuzumab CDC activity towards BT474 cells when complement regulators were inhibited with blocking mAbs or sheared by phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), however we were unable to recreate these results. Several studies reported enhanced CDC activity following knockdown of complement regulatory proteins using siRNAs (short interfering RNA or silencing RNAs), although we have not yet tested this approach. It has also been suggested that combining multiple anti-HER2 antibodies that bind different epitopes, for example Trastuzumab and Pertuzumab, may work to enhance CDC activity

Conclusions 

In this application note, we have exemplified a simple workflow for quantifying CDC activity using the iQue® Advanced Flow Cytometry Platform. Fast sample acquisition by the iQue® combined with streamlined data analysis using the iQue Forecyt® software enables rapid comparisons between antibody function to be drawn. The experiments in this note have highlighted the advantages of this workflow including: 

ƒ Low volume requirements for the iQue® allow conservation of precious antibody and serum samples and lead to a reduction in reagent costs. 

ƒ Ease of multiplexing the CDC readout with other markers and dyes allows much more information to be gathered from a single assay and negates the need to combine data from multiple sources. 

ƒ Pharmacological readouts, such as EC50 values, generated using the iQue Forecyt® software, can be used to rank antibodies based on their CDC-inducing activity. 

ƒ High-throughput data acquisition by the iQue® means that a 96-well immune assay can be read in 15 min or a 384-well in 40 min. 

This facilitates rapid screening of large antibody libraries along with the capacity to increase replication to enhance robustness of data. 

ƒ Combining CDC data with Fc function analysis using the iQue® Human ADCP Kit and iQue® Natural Killer Cell Killing Kit can provide full profiling of the three key Fc receptor mediated functions of antibodies using a single instrument. Together these advantages demonstrate the power of the iQue® to measure antibody Fc functions, such as CDC, and show the  potential for this workflow to improve antibody drug discovery processes, both through enhanced speed and quality of hits generated.

ITALIANO

Introduzione

La ricerca e lo sviluppo di terapie con anticorpi monoclonali (mAb) è un'area vasta ed in espansione della scoperta di farmaci, in gran parte a causa del potenziale mAb per l'elevata specificità e affinità verso le molecole bersaglio. L'ultimo decennio ha visto un netto aumento del numero di approvazioni per le terapie con mAb, con 11 molecole che hanno ottenuto la prima approvazione negli Stati Uniti o nell'UE nel 2021. Le terapie approvate a base di mAb coprono un'ampia gamma di aree patologiche, sebbene la maggior parte sia indicata per il trattamento dei tumori (45%), come il trattamento anti-CD20 dei tumori delle cellule B, o per i disturbi immuno-mediati (27%), come il trattamento antiTNF delle malattie infiammatorie. Esistono diversi meccanismi d'azione (MoA) attraverso i quali gli mAb sono citotossici nei confronti delle cellule bersaglio, come le cellule tumorali. Questi MoA spesso sfruttano il potere del sistema immunitario del corpo per esercitare effetti antitumorali. Esempi di ciò includono le tre funzioni chiave mediate da Fc: citotossicità cellulare dipendente da anticorpi (ADCC), fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP) e citotossicità dipendente da complemento (CDC). ADCC e ADCP si basano su un mAb che interagisce simultaneamente con i recettori Fc sulle cellule immunitarie e l'antigene sulle cellule bersaglio. Ciò porta le cellule bersaglio in prossimità di cellule citotossiche (ad esempio cellule natural killer) o cellule fagocitiche (ad esempio monociti o macrofagi), portando a una maggiore clearance immunitaria. Al contrario, nel CDC, l'mAb legato all'antigene recluta le proteine presenti nel sangue per indurre la lisi. Questo processo inizia con il legame della proteina C1q alla regione mAb Fc, che innesca l'attivazione della via del complemento. Segue una complessa cascata molecolare, che sfocia nella formazione del complesso di attacco alla membrana (MAC). Il MAC crea un poro nella membrana della cellula bersaglio, provocando la morte cellulare. Durante lo sviluppo di mAb in fase iniziale, i test in vitro vengono spesso utilizzati per profilare l'attività verso diversi MoA, incluso CDC, per garantire che gli mAb con caratteristiche desiderabili siano selezionati per la valutazione clinica. Tecniche convenzionali per misurare l'attività CDC spesso:

Richiede grandi volumi di preziosi anticorpi e campioni di siero

Utilizzare la strumentazione con acquisizione a bassa produttività (ad es. citometria a flusso tradizionale)

Sono laboriosi e dispendiosi in termini di tempo e richiedono passaggi come l'ottimizzazione del protocollo, la fissazione e lavaggi multipli

In questa nota applicativa, presentiamo un flusso di lavoro semplificato e miniaturizzato per quantificare l'induzione di mAb dell'attività CDC utilizzando la piattaforma iQue® Advanced Flow Cytometry. La combinazione dei requisiti di elevata produttività e basso volume di campione di iQue® con una rapida analisi dei dati utilizzando il software integrato iQue Forecyt® ha il potenziale per semplificare e accelerare la caratterizzazione degli anticorpi ed i processi di scoperta dei farmaci.

Metodi

Concetto di analisi

Le cellule bersaglio di interesse vengono seminate in piastre con fondo a V da 96 o 384 pozzetti. Il colorante iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) può essere utilizzato per etichettare le cellule target in modo che più tipi di cellule possano essere distinti in un singolo pozzetto (ad esempio una popolazione luminosa, medio-luminosa, debole e non colorata). Questo test è appropriato per l'uso con cellule bersaglio sia in sospensione che aderenti. Gli mAb di prova vengono aggiunti alle cellule prima che venga aggiunto il siero umano per indurre CDC. Le cellule vengono quindi lavate ed etichettate utilizzando il colorante iQue® Cell Membrane Integrity (R/Red) per consentire la quantificazione della morte cellulare. Gli anticorpi coniugati con fluoroforo possono essere inclusi in questa fase se si desidera l'espressione del marcatore di superficie cellulare. Dopo una fase di lavaggio finale, le cellule vengono risospese ed analizzate sulla piattaforma di citometria a flusso avanzata iQue®. Nel software integrato iQue Forecyt®, viene applicata una semplice strategia di gating per determinare la proporzione di cellule morte per pozzetto.

Flusso di lavoro del test 1.

Facoltativo: se si aggiungono più tipi di cellule per pozzetto, distinguere le cellule etichettandole con il colorante iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue):

1.1 Preparare uno stock di lavoro del colorante codificatore diluendo in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (ad esempio, fattore di diluizione, 1 su 1000 per colorazione brillante). Nota: se si utilizzano più di due tipi di cellule per pozzetto, il colorante brillante può essere diluito (ad esempio, 1 su 10) per creare popolazioni dimmer.

1.2 Raccogliere le cellule in una provetta conica, lavare in PBS e risospendere a 2 x 106 cellule/mL.

1.3 Aggiungere un volume uguale della soluzione colorante preparata (1:1) e incubare (37 °C, 15 min).

1.4 Lavare le cellule con almeno 2 volte il volume di terreno di coltura cellulare (compreso il 10% di siero) e centrifugare (500 g, 5 min).

1.5 Ripetere la fase di lavaggio altre due volte.

2. Preparare le cellule bersaglio a una densità appropriata in terreni di coltura cellulare privi di siero e seminare 10 µL/pozzetto in una piastra da 96 o 384 pozzetti con fondo a V (ad es. Corning 3363 o 3656). Nota: consigliare una densità cellulare iniziale di circa 5-10 K/pozzetto per ogni tipo di cellula.

3. Aggiungere 10 µl di mAb di test (preparati in terreni privi di siero) e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

4. Aggiungere 10 μL di siero umano preparato a 3 volte la concentrazione del test finale (FAC) e diluito in terreno privo di siero (ad esempio, 45% per ottenere un FAC del 15%) e incubare per 30–60 min a 37 °C. Nota: i controlli consigliati includono i soli terreni privi di siero (cioè senza siero) e/o il 15% di siero inattivato dal calore (56 °C, 30 min).

5. Aggiungere 100 µL di tampone di lavaggio (ad es. PBS + 2% FBS) e centrifugare (300 g, 5 min).

6. Rimuovere il terreno e agitare (2000 RPM, 1 min) utilizzando l'agitatore per piastre iQue® per risospendere le cellule.

7. Aggiungere 10 µl di iQue® Cell Membrane Integrity Dye (a scelta tra V/blu, B/verde, B/rosso, R/rosso) utilizzando la concentrazione raccomandata nel protocollo del colorante e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Facoltativo: in questa fase è possibile aggiungere anticorpi coniugati con fluoroforo per misurare contemporaneamente l'espressione del marcatore.

8. Lavare, centrifugare e risospendere come nei passaggi 5 e 6. Aggiungere 20 µL/pozzetto di tampone di lavaggio. 

9. Eseguire su iQue® utilizzando un tempo di 3–5 secondi ed analizzare i dati utilizzando il software iQue Forecyt®, applicando un semplice modello di gating (Figura 2).

Risultati

Il donatore di siero e la concentrazione possono influire sui livelli di CDC

Abbiamo precedentemente dimostrato che il donatore da cui vengono acquisite le cellule immunitarie per un test ADCC o ADCP può avere un grande impatto sul livello del meccanismo di uccisione mediato da anticorpi indotto. Per verificare se questo effetto si applicasse anche al CDC, abbiamo esaminato il livello di CDC in presenza di un intervallo di concentrazioni di Rituximab (anti-CD20-IgG1) con quattro diversi donatori come fonte di siero umano (Figura 3A e B) . Cellule Ramos ad alta espressione di CD20 provenienti da una linea di linfociti B sono state utilizzate come cellule bersaglio. Complessivamente, i livelli di CDC indotti da Rituximab in presenza di ciascuno dei quattro donatori erano simili, in particolare per i donatori 1, 2 e 3, tra i quali i valori EC50 per la risposta CDC variavano da 0,29 a 0,36 µg/mL. L'EC50 per CDC in presenza del siero del donatore 4 era leggermente al di fuori di questi valori a 0,53 µg/mL. Questi dati evidenziano che se si esegue uno screening anticorpale per l'attività dei CDC, può valere la pena testare l'attività con diversi donatori per garantire che si osservino tendenze simili. Tuttavia, sulla base delle nostre osservazioni, le fluttuazioni dovute al donatore di siero sono probabilmente minime e forse meno critiche rispetto a un test ADCC o ADCP (dati non mostrati).

Il processo di ottimizzazione del dosaggio includeva la misurazione di come il livello di CDC differiva con la concentrazione di siero umano aggiunto. La Figura 3C mostra l'attività CDC di Rituximab, misurata con tre diverse concentrazioni di siero dello stesso donatore. I valori EC50 nella Figura 3D mostrano un aumento generale dell'attività con l'aumento della concentrazione sierica. Per ottenere l'equilibrio tra la massimizzazione della risposta del CDC e la riduzione al minimo dell'utilizzo di entrambi i campioni di siero e anticorpi, abbiamo concluso di procedere con una concentrazione sierica del 15% per i test successivi. Livelli di espressione di CD20 sulle cellule bersaglio correlati con l'attività del CDC Diversi studi hanno mostrato collegamenti tra l'espressione di CD20 sulle cellule bersaglio cancerose e il livello di attività del CDC esercitato su di esse dagli anticorpi anti-CD20.6,7 Esperimenti successivi miravano a esplorare le differenze di CDC tra tipi di cellule in sospensione utilizzando il test iQue®. L'istogramma nella Figura 4A mostra l'espressione CD20 della superficie cellulare relativa su tre linee di cellule tumorali: Ramos, Rajis (un'altra linea cellulare di linfociti B) e Jurkats (una linea cellulare di linfociti T). Questi dati mostrano che l'espressione di CD20 è più alta sulle cellule Ramos, con un'intensità di fluorescenza mediana (MFI) x 106 di 3,08 ± 0,1, rispetto a 1,51 ± 0,03 sulle cellule Raji. L'espressione di CD20 sulle cellule Jurkat era simile al controllo di fondo IgG, con un MFI x 106 di 0,06 ± 0,0005. Per risparmiare tempo e reagenti, è stato utilizzato iQue® Cell Proliferation and Encoding (V/Blue) Dye per etichettare in modo differenziato le cellule per consentire loro di essere distinte all'interno di un singolo pozzetto, consentendo il confronto di CDC tra più anticorpi, concentrazioni e tipi di cellule utilizzando un piastra singola da 384 pozzetti. L'istogramma in Figura 4B mostra come i tipi di cellule sono stati separati, con i Rajis etichettati in modo brillante, i Ramos più debolmente etichettati ed i Jurkats senza etichetta.

Misurazione multiplex del legame alle proteine del complemento e dell'attività del CDC Per approfondire il meccanismo del CDC, può essere utile combinare la quantificazione dell'attività del CDC con la misurazione dell'espressione dei marcatori della superficie cellulare o del legame delle proteine, ad esempio quelle coinvolte nella formazione del complemento complesso. I dati nella Figura 5 mostrano i risultati di un'analisi CDC in cui un anticorpo marcato con FITC è stato incluso durante la fase di etichettatura per osservare il legame delle proteine del complemento C4c e C4b. Il C4b lega le cellule durante la cascata del complemento e viene trasformato in C4c, che rimane legato alla superficie cellulare. La posizione sulla superficie cellulare e la mancanza di occlusione di queste proteine del complemento le rende un bersaglio ideale per il legame degli anticorpi. Questo metodo non ha funzionato per misurare il legame della proteina C1q (dati non mostrati). Ciò è probabilmente dovuto al reclutamento di altre proteine in C1q nel complesso che ostacola il legame anticorpale. Invece, il suo legame dovrebbe essere misurato utilizzando la proteina C1q purificata, un metodo che è stato utilizzato in altri studi.9 I risultati nella Figura 5 mostrano che sia il CDC che il legame C4c e C4b sono aumentati in risposta all'aumento delle concentrazioni di Rituximab sui livelli elevati di CD20- esprimendo le cellule di Ramos. Il valore EC50 per l'attività CDC era di 0,17 µg/mL mentre l'EC50 per il legame C4c e C4b era di 0,64 µg/mL. Nessun legame CDC o C4c e C4b è stato osservato con l'anticorpo di controllo IgG o con la linea cellulare Jurkat antigene-negativa.

L'induzione dei meccanismi del recettore Fc dipende dall'isotipo dell'anticorpo

  Molti recenti sforzi di sviluppo di farmaci sono stati mirati a produrre la prossima generazione di terapie anticorpali con modifiche per migliorare caratteristiche come l'efficacia e la stabilità rispetto agli anticorpi nativi.10 Esempi di queste terapie di nuova generazione includono anticorpi bispecifici, ADC, nanobodies e anticorpi ingegnerizzati. Gli anticorpi possono essere ingegnerizzati tramite mutazioni nella regione Fc che possono migliorare la funzione modificando l'affinità di legame con molecole come i recettori Fc e/o le proteine C1q, che influiscono entrambe sulla funzione mediata da Fc. Qui abbiamo utilizzato iQue® per confrontare le funzioni Fc di un anticorpo anti-CD20-IgG1 basato su Rituximab con due mutanti Fc: un IgG1fut (non fucosilato) e un IgG1NQ (non glicosilato) (Figura 6). Il test CDC è stato utilizzato per questo confronto insieme a un test ADCP, che utilizzava il kit iQue® Human ADCP. Questo kit misura il livello di colocalizzazione tra cellule immunitarie fagocitiche, come monociti e macrofagi, e cellule bersaglio per fornire una lettura del livello di ADCP indotto da un mAb di prova. Il mutante IgG1NQ ha mostrato un'attività CDC simile all'anticorpo IgG1, con una risposta alla morte massima inferiore del 50% ± 2% rispetto al 66% ± 4% con l'anticorpo nativo. Al contrario, la sua attività ADCP è stata completamente abolita, con una risposta simile al controllo IgG. Ciò è probabile perché la glicosilazione dell'anticorpo è essenziale per le funzioni effettrici mediate dal recettore Fc. l'IgG1. non mutato Questo è di nuovo in linea con quanto misurato nella Figura 6 con il mutante IgG1fut che induce un'attività CDC e ADCP comparabile, ma leggermente ridotta, rispetto all'anticorpo nativo

Le cellule aderenti sono altamente resistenti al CDC

È stato stimato che circa il 90% dei tumori dell'adulto sono tumori solidi formati da tipi di cellule aderenti. È quindi fondamentale, quando sviluppiamo modelli in vitro, mirare a renderli adatti alla valutazione dell'attività antitumorale degli anticorpi contro cellule sia in sospensione che aderenti. A tal fine, oltre a utilizzare il test iQue® CDC per misurare il CDC delle cellule B indotto da mAb anti-CD20, volevamo anche misurare l'attività dell'anticorpo anti-HER2 contro le cellule dei tumori solidi, in particolare le linee cellulari del cancro al seno. La Figura 7D mostra che non vi è stato alcun impatto sulla percentuale di cellule vive quando due tipi di cellule aderenti (cellule AU565 ad alta espressione di HER2 e cellule MDA-MB-468 HER2-negative) sono state incubate con una singola concentrazione elevata (30 µg/mL ) di anticorpi anti-HER2 e siero umano. Questa stessa identica configurazione del test ha indotto alti livelli di morte del tipo di cellula antigene-positivo nel modello cellulare in sospensione con tutti e tre gli anticorpi anti-CD20, come evidenziato nella Figura 7B, con una riduzione della vitalità del 53, 57 e 59% rispetto al controllo IgG. La mancanza di attività CDC esercitata dagli anticorpi anti-HER2 sulle cellule aderenti è in linea con le fonti della letteratura, di cui alcune hanno mostrato un'attività CDC scarsa o nulla da parte di Trastuzumab.14,15 Questi studi suggeriscono che la resistenza può essere trasmessa a causa di sovraespressione delle proteine regolatrici del complemento sulla superficie delle cellule tumorali. Le proteine regolatrici del complemento CD46, CD55 e CD59 sono espresse sui tessuti normali per inibire l'attività del complemento, ma la loro sovraespressione sulla superficie di alcuni tumori è legata all'inibizione dell'attività del CDC.

Le figure 7E-G mostrano i risultati degli esperimenti di profilazione che abbiamo effettuato per confrontare l'espressione relativa dei marcatori regolatori del complemento su cinque linee cellulari: due tipi di cellule in sospensione (Ramos e Jurkats) e tre tipi di cellule aderenti (AU565, BT474 e MDA-MB -468s). Come previsto, abbiamo visto una tendenza generale verso una maggiore espressione delle proteine ​​regolatrici del complemento sulle cellule aderenti con un'espressione inferiore sulle cellule in sospensione, supportando l'ipotesi che questa possa essere la ragione della resistenza delle cellule aderenti al CDC. Dopo la conferma che le cellule aderenti esprimono livelli più elevati di proteine ​​regolatrici del complemento, abbiamo tentato di inibire queste proteine ​​per migliorare il CDC (dati non mostrati). Wang et al. (2017) hanno riportato una maggiore attività CDC di Trastuzumab nei confronti delle cellule BT474 quando i regolatori del complemento sono stati inibiti con mAb bloccanti o tagliati dalla fosfolipasi C fosfatidilinositolo-specifica (PI-PLC), tuttavia non siamo stati in grado di ricreare questi risultati.17 Diversi studi hanno riportato una maggiore attività CDC in seguito knockdown delle proteine ​​regolatrici del complemento utilizzando siRNA (RNA interferente breve o RNA silenzianti), sebbene non abbiamo ancora testato questo approccio. È stato anche suggerito che la combinazione di più anticorpi anti-HER2 che legano diversi epitopi, ad esempio Trastuzumab e Pertuzumab , può funzionare per migliorare l'attività del CDC

Conclusioni

In questa nota applicativa, abbiamo esemplificato un semplice flusso di lavoro per quantificare l'attività CDC utilizzando la piattaforma iQue® Advanced Flow Cytometry. La rapida acquisizione del campione da parte di iQue® unita all'analisi semplificata dei dati mediante il software iQue Forecyt® consente di tracciare rapidi confronti tra la funzione degli anticorpi. Gli esperimenti in questa nota hanno evidenziato i vantaggi di questo flusso di lavoro, tra cui:

I bassi requisiti di volume per iQue® consentono la conservazione di preziosi campioni di anticorpi e siero e portano a una riduzione dei costi dei reagenti.

La facilità di multiplexing della lettura del CDC con altri marcatori e coloranti consente di raccogliere molte più informazioni da un singolo dosaggio ed elimina la necessità di combinare dati da più fonti.

Le letture farmacologiche, come i valori EC50, generate utilizzando il software iQue Forecyt®, possono essere utilizzate per classificare gli anticorpi in base alla loro attività di induzione di CDC.

L'acquisizione dati ad alto rendimento da parte di iQue® significa che un test immunitario a 96 pozzetti può essere letto in 15 minuti o un test immunitario a 384 pozzetti in 40 minuti.

Ciò facilita lo screening rapido di grandi librerie di anticorpi insieme alla capacità di aumentare la replicazione per migliorare la robustezza dei dati.

La combinazione dei dati CDC con l'analisi della funzione Fc utilizzando il kit iQue® Human ADCP e iQue® Natural Killer Cell Killing Kit può fornire un profilo completo delle tre funzioni chiave degli anticorpi mediate dal recettore Fc utilizzando un unico strumento. Insieme, questi vantaggi dimostrano la potenza dell'iQue® per misurare le funzioni Fc degli anticorpi, come il CDC, e mostrano il potenziale di questo flusso di lavoro per migliorare i processi di scoperta dei farmaci anticorpali, sia attraverso una maggiore velocità che la qualità degli hit generati.

Da:

https://www.sartorius.com/download/1343244/complement-dependent-cytotoxicity-cdc-advanced-flow-cytometr-1--data.pdf