Il nuovo metodo DM-Seq profila 5 mC con risoluzione a base singola utilizzando nanogrammi di DNA / Novel DM-Seq Method Profiles 5mC at Single-Base Resolution Using Nanograms of DNA

 Il nuovo metodo DM-Seq profila 5 mC con risoluzione a base singola utilizzando nanogrammi di DNA / Novel DM-Seq Method Profiles 5mC at Single-Base Resolution Using Nanograms of DNA

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Un nuovo rapporto presenta DM-Seq (sequenziamento diretto della metilazione), un metodo privo di bisolfito per la profilazione della 5-metilcitosina (5mC) a risoluzione a base singola utilizzando quantità di nanogrammi di DNA. La tecnica consente agli scienziati di profilare il DNA utilizzando campioni molto piccoli e senza danneggiare il campione, rendendolo un potenziale candidato per l'uso nelle biopsie liquide e nella diagnosi precoce del cancro. Inoltre, a differenza dei metodi attuali, può anche identificare chiaramente 5mC senza confonderlo con altri segni comuni.

Questo lavoro è pubblicato su Nature Chemical Biology nel documento, " Sequenziamento enzimatico diretto della 5-metilcitosina a risoluzione a base singola" . "

"5mC può fungere da impronta digitale per l'identità cellulare, quindi è importante che gli scienziati abbiano il potere di isolare 5mC e solo 5mC", ha affermato Rahul Kohli, MD, PhD, professore associato di biochimica e biofisica presso l'Università della Pennsylvania, School di Medicina. “DM-Seq utilizza due enzimi per mappare 5mC e può essere applicato a campioni di DNA sparsi, il che significa che potrebbe essere utilizzato, ad esempio, negli esami del sangue che cercano il DNA rilasciato nel sangue da tumori o altre malattie dei tessuti”.

L'assenza anormale o l'eccesso di 5mC può portare ad un'espressione genica anormale, che può guidare malattie come il cancro. In effetti, alcuni modelli anormali di 5mC sono considerati firme di alcuni tipi di cancro, il che sottolinea l'importanza di disporre di un metodo di mappatura 5mC accurato e specifico.

Il metodo tradizionale per mappare 5mC, il sequenziamento del bisolfito (BS-Seq), è significativamente dannoso per il DNA e non riesce a distinguere tra 5mC ed altri tipi di metilazione come la 5-idrossimetilcitosina (5hmC). Anche i metodi sviluppati più di recente presentano carenze, tra cui la necessità di quantità relativamente elevate di DNA.

DM-Seq utilizza due enzimi, una DNA metiltransferasi di design e una DNA deaminasi, che insieme possono rilevare 5mC in modo diretto e specifico. L'accoppiamento di queste attività con adattatori resistenti alla deaminasi, hanno osservato gli autori, consente il rilevamento accurato di soli 5 mC tramite una transizione C-to-T nel sequenziamento.

I ricercatori hanno eseguito DM-Seq su campioni di tumore cerebrale di tipo glioblastoma e hanno dimostrato che, rispetto al tradizionale BS-Seq, DM-Seq era in grado di distinguere meglio 5mC da 5hmC nei siti chiave del genoma in cui i livelli di metilazione possono essere utilizzati per prevedere esiti del paziente.

I ricercatori hanno anche confrontato DM-Seq con un'altra nuova tecnica emergente di sequenziamento di 5mC nota come sequenziamento di piridina borano assistito da TET (TAPS), che viene esplorata per potenziali applicazioni nella diagnostica del cancro, dimostrando che quest'ultima ha un inconveniente precedentemente sconosciuto che riduce la sua sensibilità di rilevamento di 5mC.

"Questi risultati evidenziano i modi in cui il rilevamento diretto di 5mC da DM-Seq, piuttosto che i tradizionali metodi di sequenziamento, potrebbe far progredire gli sforzi per utilizzare il sequenziamento epigenetico a fini prognostici nella cura del cancro", ha affermato Kohli.

ENGLISH

A new report presents DM-Seq (direct methylation sequencing), a bisulfite-free method for profiling 5-methylcytosine (5mC) at single-base resolution using nanogram quantities of DNA. The technique allows scientists to profile DNA using very small samples and without damaging the sample, making it a potential candidate for use in liquid biopsies and early cancer detection. Additionally, unlike current methods, it also can clearly identify 5mC without confusing it with other common markings.

This work is published in Nature Chemical Biology in the paper, “Direct enzymatic sequencing of 5-methylcytosine at single-base resolution.”

“5mC can act as a fingerprint for cell identity, so it’s important for scientists to have the power to isolate 5mC and only 5mC,” said Rahul Kohli, MD, PhD, an associate professor of biochemistry and biophysics at the University of Pennsylvania, School of Medicine. “DM-Seq uses two enzymes to map 5mC and can be applied to sparse DNA samples which means it could be used, for example, in blood tests that look for DNA released into the blood from tumors or other diseases tissues.”

The abnormal absence or excess of 5mC can lead to abnormal gene expression, which can drive diseases such as cancers. In fact, certain abnormal patterns of 5mCs are considered signatures of some cancers—which underscores the importance of having an accurate and specific 5mC mapping method.

The traditional method for mapping 5mC, bisulfite sequencing (BS-Seq), is significantly damaging to DNA, and fails to distinguish between 5mC and other types of methylation such as 5-hydroxymethylcytosine (5hmC). More recently developed methods also have shortcomings including the requirement for relatively large amounts of DNA.

DM-Seq utilizes two enzymes, a designer DNA methyltransferase and a DNA deaminase, which together can detect 5mC directly and specifically. Coupling these activities with deaminase-resistant adapters, noted the authors, enables accurate detection of only 5mC via a C-to-T transition in sequencing.

The researchers performed DM-Seq on glioblastoma-type brain tumor samples and demonstrated that, in comparison with traditional BS-Seq, DM-Seq was better able to distinguish 5mC from 5hmC at key sites on the genome where methylation levels can be used to predict patient outcomes.

The researchers also compared DM-Seq to another new, emerging 5mC-sequencing technique known as TET-assisted pyridine borane sequencing (TAPS), which is being explored for potential applications in cancer diagnostics, showing that the latter has a previously undiscovered drawback that reduces its 5mC-detection sensitivity.

“These findings highlight ways in which direct detection of 5mC from DM-Seq, rather than traditional sequencing methods, could advance efforts to use epigenetic sequencing for prognostic purposes in cancer care,” Kohli said.

Da:

https://www.genengnews.com/topics/omics/novel-dm-seq-method-profiles-5mc-at-single-base-resolution-using-nanograms-of-dna/