Avvertenze per evitare l'uso di CRISPR-Cas9 su embrioni umani rafforzati da nuove scoperte / Warnings to Avoid Using CRISPR-Cas9 on Human Embryos Reinforced by New Findings

 Avvertenze per evitare l'uso di CRISPR-Cas9 su embrioni umani rafforzati da nuove scoperte / Warnings to Avoid Using CRISPR-Cas9 on Human Embryos Reinforced by New Findings

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Già nel 2015, gli scienziati avevano messo in guardia contro l’uso della tecnologia CRISPR-Cas9 per modificare i genomi della linea germinale. In effetti, una prospettiva pubblicata quell’anno su Science suggeriva che applicazioni di cura delle malattie altrimenti ineccepibili avrebbero potuto collocare l’ingegneria del genoma umano su un “pendio scivoloso” verso la modificazione genetica della linea germinale, con conseguenze imprevedibili.

Quando l’avvertimento contro l’editing della linea germinale fu ignorato dallo scienziato cinese He Jiankui, PhD, almeno alcune delle conseguenze erano prevedibili. La comunità scientifica era scioccata, addirittura inorridita. E le autorità cinesi hanno avviato un'indagine. Alla fine, He Jiankui è stato licenziato dalla sua università, la Southern University of Science and Technology di Shenzhen. Ha ricevuto anche una pesante multa, una pena detentiva di tre anni ed il divieto di ulteriori ricerche sulle tecnologie di riproduzione assistita.

Se la rivelazione dei “CRISPR Babies” ha portato a chiari risultati professionali e legali, i risultati scientifici, per non parlare delle conseguenze sulla salute individuale, sono rimasti oscuri. Tuttavia, una certa chiarezza scientifica è emersa questa settimana, in occasione del 39esimo incontro annuale della Società Europea di Riproduzione Umana ed Embriologia (ESHRE). In questo incontro, una delle relatrici, Nada Kubikova, DPhil dell'Università di Oxford, ha riferito che le cellule dei primi embrioni umani spesso non sono in grado di riparare i danni al loro DNA.

Durante la sua presentazione, intitolata “Deficienza di riparazione della rottura del doppio filamento del DNA negli embrioni umani preimpianto rivelata da CRISPR-Cas9”, Kubikova ha suggerito che un’insufficiente riparazione del DNA negli embrioni ha implicazioni importanti. "L'editing genetico ha il potenziale per correggere i geni difettosi, un processo che di solito comporta prima la rottura e poi la riparazione del filamento di DNA", ha detto Kubikova. “Le nostre nuove scoperte forniscono un avvertimento sul fatto che le tecnologie di editing genetico comunemente utilizzate potrebbero avere conseguenze indesiderate e potenzialmente pericolose se applicate agli embrioni umani”.

Ha descritto come ha valutato lo strumento di modifica genetica, CRISPR-Cas9, per tagliare e sostituire sezioni di DNA nelle cellule embrionali precoci.

“I nostri risultati mostrano che l’uso di CRISPR-Cas9 negli embrioni umani precoci comporta rischi significativi”, ha affermato. “Abbiamo scoperto che il DNA delle cellule embrionali può essere preso di mira con elevata efficienza, ma sfortunatamente questo raramente porta al tipo di cambiamenti necessari per correggere un gene difettoso. Più spesso, il filamento del DNA è permanentemente rotto, il che potrebbe potenzialmente portare ad ulteriori anomalie genetiche nell’embrione”.

L’editing genetico ha iniziato ad essere utilizzato nei bambini e negli adulti con malattie causate da mutazioni genetiche come la fibrosi cistica, il cancro e l’anemia falciforme. Molti altri disturbi ereditari potrebbero essere evitati se si potesse effettuare l’editing genetico sugli embrioni prima che si impiantano nell’utero, poiché questa è l’unica fase di sviluppo in cui si può garantire che la tecnologia CRISPR-Cas9 raggiunga ogni cellula dell’embrione. Tuttavia, poiché ha il potenziale di creare cambiamenti nel genoma umano che potrebbero essere tramandati di generazione in generazione, ed a causa dell’incertezza sulla sua sicurezza, il suo utilizzo negli embrioni è attualmente vietato nella maggior parte dei paesi del mondo.

“Rimangono ancora lacune significative nelle nostre conoscenze”, ha osservato Kubikova. “Volevamo valutare se CRISPR-Cas9 potesse essere un metodo efficace per correggere gli errori genetici negli embrioni umani e far luce sulla sicurezza di tali metodi”.

In uno studio eticamente approvato, Kubikova e i suoi colleghi hanno fecondato ovuli donati con sperma donato utilizzando l’iniezione intracitoplasmatica di sperma per creare 84 embrioni. In 33 embrioni, hanno utilizzato CRISPR-Cas9 per creare rotture nei due filamenti che compongono la molecola di DNA.

"Abbiamo utilizzato CRISPR per colpire le aree del DNA che non contengono geni", ha sottolineato Kubikova. “Questo perché volevamo imparare cosa è sempre vero riguardo al modo in cui CRISPR influenza le cellule embrionali ed il loro DNA, e non lasciarci distrarre dai cambiamenti causati dall’interruzione di un particolare gene”.

I restanti 51 embrioni sono stati mantenuti come controlli.

"Tutte le cellule del corpo hanno meccanismi altamente efficienti per riparare i danni che colpiscono il loro DNA", ha continuato Kubikova. “Nella maggior parte dei casi, le estremità dei filamenti di DNA rotti vengono rapidamente ricollegate. Questo è molto importante, poiché la persistenza di un danno al DNA non riparato impedisce alle cellule di funzionare correttamente e può essere letale. Il modo più comune con cui le cellule riparano il DNA è ricollegando le due estremità del filamento di DNA, anche se quando ciò accade è comune che alcune lettere del codice genetico vengano cancellate o duplicate nel punto in cui i filamenti vengono riattaccati. Ciò può disturbare i geni e non consentire la correzione delle mutazioni. Questo è noto come unione delle estremità non omologhe.

“Un altro modo in cui le cellule possono riparare una rottura nel DNA è utilizzare una copia intatta dell’area interessata come modello, copiarla e sostituire l’area danneggiata mentre lo fa. È possibile fornire alle cellule pezzi di DNA contenenti sequenze di DNA leggermente alterate, ad esempio aventi una sequenza normale anziché una mutazione. La cellula può quindi utilizzare questi modelli quando ripara la rottura prodotta da CRISPR, rimuovendo il pezzo rotto di DNA e copiando contemporaneamente il resto della sequenza fornita. Questo è noto come riparazione diretta dall’omologia ed è il processo necessario per correggere una mutazione”.

I ricercatori hanno rilevato alterazioni nei siti target del DNA in 24 embrioni su 25, indicando che CRISPR è altamente efficiente nelle cellule degli embrioni umani. Tuttavia, solo il 9% dei siti target è stato riparato utilizzando il processo clinicamente utile della riparazione diretta dall’omologia e il 51% dei filamenti di DNA rotti è stato sottoposto a unione delle estremità non omologhe, producendo mutazioni nei punti in cui i filamenti venivano ricollegati. Il restante 40% dei filamenti di DNA rotti non è stato riparato. Le rotture non riparate nei filamenti di DNA alla fine hanno portato alla perdita od alla duplicazione di grandi pezzi di cromosoma, che si estendono dal sito della rottura fino alla fine del cromosoma. Anomalie di questo tipo influiscono sulla vitalità degli embrioni e, se gli embrioni affetti venissero trasferiti nell'utero e generassero un bambino, comporterebbero il rischio di gravi anomalie congenite.

"Il nostro studio mostra che la riparazione diretta dall'omologia è rara nei primi embrioni umani e che, nei primi giorni di vita, le cellule degli embrioni umani lottano per riparare i filamenti di DNA rotti", ha sottolineato Kubikova. “CRISPR-Cas9 si è rivelato straordinariamente efficiente nel prendere di mira il sito del DNA. Tuttavia, la maggior parte delle cellule ha riparato la rottura del DNA indotta da CRISPR utilizzando l’unione delle estremità non omologhe, un processo che introduce mutazioni aggiuntive anziché correggere quelle esistenti. Ciò rappresenterebbe una sfida se si tentasse di utilizzare CRISPR-Cas9 per correggere i disturbi ereditari negli embrioni umani, poiché suggerisce che la maggior parte delle volte in cui viene tentato, non avrà successo.

“Sebbene i risultati mettano in guardia contro l’uso dell’editing genomico negli embrioni umani, ci sono stati alcuni risultati positivi, che suggeriscono che i rischi possono essere ridotti e la capacità di rimuovere con successo le mutazioni può essere aumentata modificando il modo in cui viene effettuato l’editing genomico. Ciò offre speranza per futuri miglioramenti alla tecnologia.

“In media, solo circa un quarto degli embrioni creati mediante la fecondazione in vitro (IVF) riescono a produrre un bambino. La metà di essi smette di svilupparsi in laboratorio prima di poter essere trasferita nell'utero. L’incapacità degli embrioni di riparare efficacemente i danni al DNA, rivelata da questo studio, può spiegare perché alcuni embrioni IVF non riescono a svilupparsi. Questa comprensione può portare a migliori trattamenti di fecondazione in vitro”.

Ora i ricercatori cercheranno nuovi modi per proteggere gli embrioni precoci dai danni al DNA, che potrebbero portare a potenziali miglioramenti nei trattamenti per la fertilità. Hanno anche in programma di esplorare metodi più delicati di editing genetico che evitino la rottura dei filamenti del DNA, che gli embrioni potrebbero trovare più facile da affrontare.

“In futuro, tali metodi potrebbero offrire la possibilità di invertire le mutazioni che hanno rovinato le famiglie per generazioni, prevenendo l’ereditarietà di disturbi catastrofici”, ha concluso Kubikova.

La ricerca è stata commentata da Karen Sermon, PhD, professoressa di genetica ed embriologia alla Vrije Universiteit Brussel e presidente eletto dell'ESHRE. "Questo è uno studio eccellente della dottoressa Kubikova e dei suoi colleghi", ha detto Sermon. “Ciò sottolinea l’importanza del motivo per cui l’editing genetico deve essere studiato e compreso a fondo prima che venga fatto qualsiasi tentativo di modificare geneticamente gli embrioni umani.

“Penso che sia probabile che l'editing genetico diventi uno strumento utile in futuro per prevenire la nascita di bambini con gravi malattie genetiche in un numero limitato di casi in cui i test genetici preimpianto non sarebbero applicabili. Tuttavia, questa ricerca mostra uno dei modi in cui può andare storto. Ci vorrà del tempo prima di poter essere sicuri di capire davvero come usarlo con successo senza sorprese indesiderate ed inaspettate. Richiederà una regolamentazione rigorosa. Nel frattempo, un’attenta ricerca come questa ci porta un passo avanti e può anche aiutare a capire come migliorare i trattamenti per la fertilità”.

ENGLISH

As far back as 2015, scientists have been warning against using CRISPR-Cas9 technology to modify germline genomes. Indeed, a perspective published that year in Science suggested that otherwise unexceptionable disease-curing applications could place human genome engineering on a “slippery slope” toward germline gene modification, with unpredictable consequences.

When the warning against germline editing was ignored by Chinese scientist He Jiankui, PhD, at least some of the consequences were predictable. The scientific community was shocked, even aghast. And Chinese authorities launched an investigation. Ultimately, He Jiankui was fired by his university, the Southern University of Science and Technology in Shenzhen. He also received a hefty fine, a three-year prison sentence, and a ban from further research in assisted reproductive technologies.

If the “CRISPR Babies” revelation led to clear professional and legal outcomes, the scientific outcomes, to say nothing of the individual health consequences, remained murky. However, a degree of scientific clarity became evident this week, at the 39th annual meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). At this meeting, one of the presenters, the University of Oxford’s Nada Kubikova, DPhil, reported that the cells of early human embryos are often unable to repair damage to their DNA.

During her presentation, which was titled, “Deficiency of DNA double-strand break repair in human preimplantation embryos revealed by CRISPR-Cas9,” Kubikova suggested that insufficient DNA repair in embryos has important implications. “Gene editing has the potential to correct defective genes, a process that usually involves first breaking and then repairing the DNA strand,” Kubikova said. “Our new findings provide a warning that commonly used gene editing technologies may have unwanted and potentially dangerous consequences if they are applied to human embryos.”

She described how she evaluated the gene editing tool, CRISPR-Cas9, to cut out and replace sections of DNA in early embryo cells.

“Our results show that the use of CRISPR-Cas9 in early human embryos carries significant risks,” she said. “We have found that the DNA of embryo cells can be targeted with high efficiency, but unfortunately this rarely leads to the sort of changes needed to correct a defective gene. More often, the strand of DNA is permanently broken, which could potentially lead to additional genetic abnormalities in the embryo.”

Gene editing has begun to be used in children and adults with diseases caused by gene mutations such as cystic fibrosis, cancer, and sickle-cell disease. Many more inherited disorders could be avoided if gene editing could be carried out on embryos before they implant in the womb, since this is the only stage of development when CRISPR-Cas9 technology can be guaranteed to reach every cell of the embryo. However, because it has the potential to create changes in the human genome that would be passed down through generations, and because of uncertainty about its safety, its use in embryos is currently banned in most countries worldwide.

“Significant gaps in our knowledge still remain,” Kubikova noted. “We wanted to evaluate whether CRISPR-Cas9 could be an effective method for correcting genetic mistakes in human embryos and to shed light on whether such methods would be safe to use.”

In an ethically approved study, Kubikova and her colleagues fertilized donated eggs with donated sperm using intracytoplasmic sperm injection to create 84 embryos. In 33 of the embryos, they used CRISPR-Cas9 to create breaks in the two strands that make up the DNA molecule.

“We used CRISPR to target areas of the DNA that don’t contain any genes,” Kubikova pointed out. “This is because we wanted to learn what is always true about how CRISPR affects embryo cells and their DNA, and not be distracted by changes caused by disrupting a particular gene.”

The remaining 51 embryos were kept as controls.

“All the cells of the body have highly efficient mechanisms for repairing damage affecting their DNA,” Kubikova continued. “In most cases, the ends of broken DNA strands are quickly reconnected. This is very important, as the persistence of unrepaired DNA damage stops cells working properly and can be lethal. The most common way that cells repair DNA is by reconnecting the two ends of the DNA strand, although when this happens it is common for a few letters of genetic code to be deleted or duplicated at the site where the strands are reattached. This can disrupt genes and does not allow mutations to be corrected. This is known as nonhomologous end joining.

“Another way cells can repair a break in the DNA is by using an intact copy of the affected area as a template, copying it, and replacing the damaged area as it does so. It is possible to supply the cells with pieces of DNA containing slightly altered DNA sequences, such as having a normal sequence rather than a mutation. The cell may then use these templates when it repairs the break produced by CRISPR, removing the broken piece of DNA and copying the rest of the supplied sequence at the same time. This is known as homology-directed repair and is the process required for correcting a mutation.”

The researchers detected alterations at the targeted DNA sites in 24 out of 25 embryos, indicating that CRISPR is highly efficient in the cells of human embryos. However, only 9% of targeted sites were repaired using the clinically useful process of homology-directed repair, and 51% of broken DNA strands underwent nonhomologous end joining, producing mutations where the strands were reconnected. The remaining 40% of broken DNA strands failed to be repaired. The unrepaired breaks in the DNA strands eventually led to large pieces of chromosome, which extend from the site of the break to the end of the chromosome, being lost or duplicated. Abnormalities of this type affect the viability of embryos and if affected embryos were transferred to the uterus and produced a baby, they would carry a risk of serious congenital abnormalities.

“Our study shows that homology-directed repair is infrequent in early human embryos and that, in the first few days of life, the cells of human embryos struggle to repair broken DNA strands,” Kubikova emphasized. “CRISPR-Cas9 was remarkably efficient in targeting the DNA site. However, the majority of cells repaired the DNA break induced by CRISPR using nonhomologous end joining, a process that introduces additional mutations rather than correcting existing ones. This would be a challenge if there were attempts to use CRISPR-Cas9 to correct inherited disorders in human embryos, as it suggests that most times when it is attempted, it will not be successful.

“While the results caution against the use of genome editing in human embryos, there were some positive findings, suggesting that risks can be lowered and the ability to successfully remove mutations can be increased by modifying the way in which genome editing is undertaken. This offers hope for future improvements to the technology.

“On average, only about a quarter of the embryos created using in vitro fertilization (IVF) succeed in producing a baby. Half of them stop developing in the laboratory before they can be transferred to the womb. The inability of embryos to efficiently repair DNA damage, revealed by this study, may explain why some IVF embryos fail to develop. This understanding may lead to improved IVF treatments.”

Now, the researchers will look for new ways to protect early embryos from DNA damage, which could lead to potential improvements in fertility treatments. They also plan to explore more gentle methods of gene editing that avoid breakage of the DNA strands, which embryos might find easier to cope with.

“In the future, such methods may offer the possibility of reversing mutations that have blighted families for generations, preventing the inheritance of catastrophic disorders,” Kubikova concluded.

The research was commented on by Karen Sermon, PhD, professor in genetics and embryology at the Vrije Universiteit Brussel, and the chair-elect of ESHRE. “This is an excellent study by Dr. Kubikova and her colleagues,” Sermon said. “It underlines the importance of why gene editing needs to be thoroughly researched and understood before any attempt is made to gene edit human embryos.

“I think it’s likely that gene editing will become a useful tool at some point in the future for preventing babies from being born with serious genetic diseases in a restricted number of cases where preimplantation genetic testing would not apply. However, this research shows one of the ways that it can go wrong. It will be some time before we can be confident that we really understand how to use it successfully without any unwanted and unexpected surprises. It will require stringent regulation. In the meantime, careful research such as this brings us one step closer, and it may also help with understanding how to improve fertility treatments.”

Da:

https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/warnings-to-avoid-using-crispr-cas9-on-human-embryos-reinforced-by-new-findings/?MailingID=%DEPLOYMENTID%&utm_medium=newsletter&utm_source=GEN+Daily+News+Highlights&utm_content=01&utm_campaign=GEN+Daily+News+Highlights_20231226&oly_enc_id=8653B6936723E0S