L'analizzatore metabolico offre una finestra sulla coltura cellulare / Metabolic analyser offers a window into cell culture
L'analizzatore metabolico offre una finestra sulla coltura cellulare / Metabolic analyser offers a window into cell culture
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Il monitoraggio continuo ed in tempo reale degli indicatori metabolici potrebbe trasformare il modo in cui tracciamo le colture di cellule ed organoidi, con potenziali applicazioni per la medicina rigenerativa.
Le colture cellulari sono strumenti vitali nella ricerca biologica, dal servire come sistemi modello per studiare la biochimica e la fisiologia, fino alle applicazioni nello screening dei farmaci e nella produzione di vaccini. La capacità di monitorare le condizioni delle cellule, in particolare in strutture complesse come gli organoidi, è essenziale.
Monitorare il metabolismo cellulare – la serie di reazioni che si verificano nelle colture cellulari e forniscono l’energia necessaria per sostenere la vita – è un modo per accertare se una coltura cellulare sta procedendo bene. Negli ultimi anni si è passati dal semplice vedere se le cellule sopravvivevano all'effettuare misurazioni dettagliate per stimare la quantità di glucosio che le cellule utilizzano come energia ed il lattato che producono come sottoprodotti.
Invece di misurare periodicamente le concentrazioni di questi indicatori cruciali del successo della coltura cellulare, tuttavia, gli scienziati preferiscono monitorare continuamente il glucosio ed il lattato in tempo reale.
Questo è proprio ciò che la PHC Corporation, sede della Divisione Biomedica del Gruppo PHC, sta aiutando gli scienziati a realizzare. PHC Group è un insieme globale di aziende sanitarie che sviluppano, producono, vendono e forniscono assistenza per soluzioni di gestione del diabete, soluzioni sanitarie, diagnostica e scienze della vita.
Complessità crescente
La crescente complessità delle colture cellulari, come il passaggio dai formati bidimensionali a quelli tridimensionali, come gli organoidi, ha stimolato la necessità di monitorare accuratamente il metabolismo. In questo modo, gli scienziati possono valutare le condizioni di un insieme di cellule.
Gli organoidi costituiscono una delle forme più complesse di coltura cellulare odierne. Queste raccolte tridimensionali di vari tipi di cellule imitano la struttura di un organo. Di conseguenza, gli organoidi possono essere utilizzati per studiare i fondamenti del metabolismo, soprattutto con il monitoraggio continuo dei processi cellulari.
Gli organoidi potrebbero anche essere potenzialmente utilizzati nello sviluppo di nuove terapie e medicina rigenerativa, che mira a creare cellule, tessuti ed organi potenzialmente completi che potrebbero sostituire quelli danneggiati dalla malattia.
Masaki Kimura è un ricercatore associato nella divisione di gastroenterologia, epatologia e nutrizione presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center in Ohio, negli Stati Uniti. Sta utilizzando una combinazione di ingegneria tissutale e tecnologia delle cellule staminali per creare organoidi epatici da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).
"Le iPSC hanno la capacità di differenziarsi in diversi tipi di cellule funzionali, inclusi gli epatociti - che sono i principali attori del fegato - così come altre cellule, come i macrofagi del sistema immunitario", afferma Kimura. “La ricostruzione delle cellule e del tessuto epatico utilizzando questo approccio innovativo potrebbe fornire soluzioni per il trattamento delle malattie epatiche, affrontando problemi come il danno tissutale e l’insufficienza d’organo”.
Più realistico
Oltre ad utilizzare organoidi epatici per rigenerare i tessuti danneggiati, queste cellule in coltura potrebbero essere utilizzate nello sviluppo di nuove terapie, afferma Kimura, ma tale applicazione richiede “cellule epatiche di alta qualità in grado di formare un organoide epatico, con funzioni metaboliche avanzate come quelle umane”. ," lui dice.
Per creare un organoide epatico che sia un buon modello del metabolismo in un fegato reale, Kimura ha bisogno di un modo per misurare accuratamente le caratteristiche del metabolismo in colture cellulari complesse, come gli organoidi.
Effettuare misurazioni poco frequenti dei livelli di glucosio e lattato non fornisce il livello di dettaglio richiesto, spiega: "La sfida delle misurazioni metaboliche convenzionali delle colture cellulari è che le differenze con ciascun punto temporale sono così grandi che è difficile rilevare i cambiamenti dinamici nel metabolismo."
Ma un nuovo dispositivo sviluppato da PHC potrebbe aiutare a risolvere alcuni di questi problemi. In qualità di beta tester dell'analizzatore metabolico di cellule vive (LiCellMo) dell'azienda, Kimura afferma di essere stato in grado di raccogliere informazioni molto più complete dai suoi organoidi epatici rispetto a prima.
LiCellMo utilizza 24 sensori in linea proprietari che forniscono il monitoraggio continuo delle concentrazioni di glucosio e lattato nei mezzi utilizzati per coltivare le cellule in una piastra a 24 pozzetti. Questi sensori misurano le correnti elettrochimiche generate quando le reazioni enzimatiche del glucosio e del lattato producono elettroni.
Pertanto, invece di raccogliere campioni dei terreni di coltura cellulare per l'analisi una o due volte al giorno, LiCellMo genera automaticamente un flusso continuo di dati. Gli scienziati possono usarlo per studiare i cambiamenti metabolici nel tempo in base all'assorbimento di glucosio ed alla produzione di lattato.
Dati continui
Tali dati continui aiutano gli scienziati a monitorare i cambiamenti nel tempo nel metabolismo delle cellule in coltura, offrendo una comprensione più profonda di come quelle cellule, o sistemi di cellule, si comportano o rispondono ai farmaci.
"Utilizzando LiCellMo per quantificare il glucosio rimanente nei terreni di coltura, possiamo rilevare cambiamenti nel comportamento metabolico", afferma Kimura.
Invece di misurare esclusivamente l’assorbimento del glucosio, Kimura sta utilizzando il LiCellMo per studiare anche la creazione del glucosio, o gluconeogenesi, un processo comune negli organismi viventi. La gluconeogenesi svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dei nostri livelli di glucosio, ma questo equilibrio è alterato in alcune malattie, tra cui il diabete di tipo 2 e la steatosi epatica non alcolica.
Il LiCellMo può anche aiutare a rivelare l'equilibrio tra glicolisi e fosforilazione ossidativa. La glicolisi è la scomposizione dei carboidrati, come il glucosio, negli organismi viventi per rilasciare energia e lattato come sottoprodotto. La fosforilazione ossidativa è una via metabolica che porta alla produzione di adenosina trifosfato (ATP), una molecola organica che fornisce l'energia per molti processi cellulari.
Oltre a comprendere la biologia di base della produzione di energia, l'equilibrio tra glicolisi e fosforilazione ossidativa può essere utilizzato nella ricerca clinica. Ad esempio, la glicolisi è ridotta in alcune aree del cervello in diverse malattie neurodegenerative, compreso l'Alzheimer. Inoltre, alcune cellule tumorali dipendono dalla fosforilazione ossidativa più di quanto facciano le cellule sane.
Potendo misurare in dettaglio la differenza in questi processi a livello cellulare in laboratorio, i ricercatori potrebbero essere in grado di sviluppare nuove conoscenze su una serie di malattie.
Oltre a raccogliere dati sulla condizione degli organoidi epatici, Kimura afferma di aver utilizzato LiCellMo per migliorare i suoi protocolli di ricerca. Per evitare l'accumulo di lattato, un prodotto di scarto che può essere tossico, gli scienziati che praticano colture cellulari cambiano regolarmente i terreni. In passato, Kimura cambiava i terreni di coltura per i suoi organoidi ogni quattro giorni. Tuttavia, monitorando i livelli di lattato con il LiCellMo, ha scoperto che i mezzi dovrebbero essere cambiati a giorni alterni. "LiCellMo è stato davvero utile per creare un protocollo per il mantenimento o la differenziazione cellulare", afferma.
Applicazioni future
Sebbene Kimura si sia concentrato sulla ricerca di base, immagina modi per applicare LiCellMo ai sistemi di produzione. "Nelle colture commerciali automatizzate, le misurazioni continue del glucosio sarebbero davvero una buona parte del sistema", afferma.
Per ora, sta incorporando il LiCellMo nello screening farmacologico con i suoi organoidi epatici. "Ma in futuro speriamo di usarlo per produrre tessuto epatico funzionale che potrebbe essere utilizzato per i trapianti", afferma. "LiCellMo ci aiuta davvero a migliorare il nostro modello di fegato."
ENGLISH
Continuous, real-time monitoring of metabolic indicators could transform the way we track cultures of cells and organoids, with potential applications for regenerative medicine.
Cell cultures are vital tools in biological research, from serving as model systems to study biochemistry and physiology, through to applications in drug screening and vaccine production. The ability to monitor the condition of cells, particularly in complex structures such as organoids, is essential.
Tracking cellular metabolism — the series of reactions that occur in cell cultures and provide the energy required to sustain life — is one way to ascertain if a cell culture is progressing well. In recent years this has evolved from simply seeing if cells survived, to taking detailed measurements to estimate how much glucose the cells use as energy, and lactate they produce as byproducts.
Instead of periodically measuring the concentrations of these crucial indicators of cell-culture success, however, scientists would rather continuously track glucose and lactate in real time.
That’s just what PHC Corporation, home of the Biomedical Division of PHC Group, is helping scientists accomplish. PHC Group is a global collection of healthcare companies that develop, manufacture, sell and service solutions across diabetes management, healthcare solutions, diagnostics, and life sciences.
Increasing complexity
The increasing complexity of cell cultures, such as the move from two-dimensional to three-dimensional formats, such as organoids, has spurred the need to accurately track metabolism. In this way, scientists can assess the condition of a collection of cells.
Organoids make up one of today’s most complex forms of cell culture. These three-dimensional collections of various cell types mimic the structure of an organ. Consequently, organoids can be used to study the fundamentals of metabolism, especially with continuous monitoring of cellular processes.
Organoids could also potentially be used in the development of new therapies and regenerative medicine, which aims to create cells, tissues, and potentially complete organs that could replace those damaged by disease.
Masaki Kimura is a research associate in the division of gastroenterology, hepatology and nutrition at the Cincinnati Children’s Hospital Medical Center in Ohio in the United States. He is using a combination of tissue engineering and stem-cell technology to create liver organoids from induced pluripotent stem cells (iPSCs).
“iPSCs have the capability to differentiate into diverse, functional cell types, including hepatocytes — which are the main players in the liver — as well as other cells, such as the immune system’s macrophages,” Kimura says. “Reconstructing liver cells and liver tissue using this innovative approach could provide solutions for treating liver disease, addressing issues such as tissue damage and organ failure.”
More realistic
Beyond using liver organoids for regenerating damaged tissues, these cultured cells could be used in the development of new therapies, says Kimura, but that application requires “high-quality liver cells that can form a liver organoid, with advanced metabolic functions like those in humans,” he says.
To make a liver organoid that’s a good model of the metabolism in a real liver, Kimura needs a way to accurately measure the features of metabolism in complex cell cultures, such as organoids.
Taking infrequent measurements of glucose and lactate levels does not provide the required level of detail, he explains: “The challenge of the conventional metabolic measurements of cell cultures is that the differences with each time point are so large that it’s difficult to detect the dynamic changes in the metabolism.”
But a new device developed by PHC may help solve some of these problems. As a beta tester of the company’s Live Cell Metabolic Analyzer (LiCellMo), Kimura says he was able to collect far more complete information from his liver organoids than he had previously.
The LiCellMo uses 24 proprietary in-line sensors that provide continuous monitoring of glucose and lactate concentrations in the media being used to culture cells in a 24-well plate. These sensors measure the electrochemical currents generated when enzymatic reactions of glucose and lactate produce electrons.
So, instead of collecting samples of the cell-culture media for analysis once or twice a day, the LiCellMo automatically generates a continuous stream of data. Scientists can use this to study metabolic changes over time based on the uptake of glucose and the production of lactate.
Continuous data
Such continuous data helps scientists track changes over time in the metabolism of cells in culture, offering a deeper understanding of how those cells, or systems of cells, perform or respond to drugs.
“By using the LiCellMo to quantify the remaining glucose in culture media, we can detect changes in metabolic behaviour,” Kimura says.
Instead of measuring solely glucose uptake, Kimura is using the LiCellMo to also study the creation of glucose, or gluconeogenesis, a common process in living organisms. Gluconeogenesis plays a fundamental role in maintaining our glucose levels, but this balance is upset in some diseases, including type 2 diabetes and nonalcoholic fatty liver disease.
The LiCellMo can also help reveal the balance between glycolysis and oxidative phosphorylation. Glycolysis is the breakdown of carbohydrates, such as glucose, in living organisms to release energy and lactate as a byproduct. Oxidative phosphorylation is a metabolic pathway that results in the production of adenosine triphosphate (ATP), an organic molecule that provides the energy for many cellular processes.
In addition to understanding the basic biology of energy production, the balance between glycolysis and oxidative phosphorylation can be used in clinical research. For example, glycolysis is reduced in some areas of the brain in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s. Plus, some cancer cells depend on oxidative phosphorylation more than healthy cells do.
By being able to measure the difference in these processes in detail at the cellular level in the lab, researchers may be able to develop new insights into a range of diseases.
In addition to collecting data on the condition of liver organoids, Kimura says he has been using LiCellMo to improve his research protocols. To avoid the accumulation of lactate, a waste product that can be toxic, cell-culture scientists change the media on a regular basis. In the past, Kimura changed the culture media for his organoids every four days. However, by tracking lactate levels with the LiCellMo, he found that the media should be changed every other day. “The LiCellMo has been really helpful for making a protocol for cell maintenance or cell differentiation,” he says.
Future applications
Although Kimura has focused on basic research, he envisions ways to apply LiCellMo to manufacturing systems. “In automated commercial cultures, continuous measurements of glucose would be a really good part of the system,” he says.
For now, he is incorporating the LiCellMo in drug screening with his liver organoids. “But in the future, we hope to use it to make functional liver tissue that could be used for transplantation,” he says. “The LiCellMo really helps us improve our liver model.”
Da:
https://www.nature.com/articles/d42473-024-00009-2?utm_source=facebook&utm_medium=social&utm_campaign=MEDR_BRCON_AWA1_GL_PCFU_CFULF_PHC-MTB-AP24&utm_id=120206308899370572&utm_content=120206457653000572&utm_term=120206457653010572&fbclid=IwAR1hRg4Cs8lA4OlvLlGxFPwRgfKfiLWDGHntgPJyeSrn3LhsvUbaKYd7y4A_aem_AWWAd22gHJtUsXuAIk7Z6i7kUtoLs2z9qi0zs0gFCjwWIQWNZwXU9n4vBLpgDkB2ekl0islXNAiYj9eHGKT8Apwu
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