Sondare il mondo interiore delle cellule fornisce una spinta inaspettata al Prime Editing / Probing the Inner World of Cells Provides Unexpected Boost to Prime Editing
Sondare il mondo interiore delle cellule fornisce una spinta inaspettata al Prime Editing / Probing the Inner World of Cells Provides Unexpected Boost to Prime Editing
Segnalato dalDott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Prime editing è il “nuovo arrivato” per l’editing del genoma, offrendo agli scienziati un controllo preciso su come vengono modificate le sequenze del genoma. Sebbene sia nuova, la tecnica è già stata ampiamente utilizzata nella ricerca sul cancro, per ripristinare la normale funzione delle cellule dei pazienti affetti da anemia falciforme e per inserire in modo efficiente grandi segmenti di DNA nelle piante, tra le altre applicazioni.
"Il prime editing è uno strumento di editing genomico incredibilmente potente", ha affermato la dott.ssa Britt Adamson, assistente professore di biologia molecolare all'Università di Princeton.
Ancora agli inizi rispetto ad altre tecniche di editing genomico più consolidate, il prime editing presenta un difetto; sebbene sia incredibilmente preciso e versatile, può essere lento e produrre modifiche con bassa efficienza.
Adamson e colleghi di Princeton hanno esplorato diversi approcci per affrontare questo inconveniente. In Nature condividono un nuovo editor principale più efficiente.
I processi cellulari sconosciuti aiutano o ostacolano il prime editing?
I prime editor sono macchine molecolari costituite da una variante Cas9 ingegnerizzata fusa con un enzima trascrittasi inversa. L'elemento Cas9 è guidato al sito bersaglio da un RNA guida di editing primario, o pegRNA, che consente il legame del DNA e l'attività della nickasi sequenza-specifica, mentre la trascrittasi inversa produce una molecola di DNA che codifica la mutazione desiderata.
Adamson e Jun Yan, uno studente laureato del gruppo di ricerca di Adamson, hanno ipotizzato che i processi sconosciuti che si verificano nelle cellule potrebbero potenzialmente ostacolare od accelerare il prime editing. "Per identificare i determinanti cellulari del prime editing, abbiamo sviluppato reporter scalabili di prime editing ed eseguito schermi di interferenza CRISPR su scala genomica (CRISPRi)", hanno spiegato i ricercatori .
Yan ha deciso che avrebbe prima progettato una linea cellulare che emettesse fluorescenza verde quando venivano inserite modifiche prime specifiche. Successivamente, ha bloccato sistematicamente l’espressione delle proteine che sono tipicamente espresse in quelle cellule e ha misurato la fluorescenza per valutare quale di quelle proteine influenzasse il processo di editing primario.
Yan ha identificato 36 determinanti cellulari del prime editing e solo uno – una piccola proteina legante l’RNA chiamata La – ha promosso il prime editing. In normali condizioni fisiologiche, il La si lega ad alcune sequenze di DNA che si trovano alle estremità delle molecole di RNA e le protegge dalla degradazione. Queste sequenze, note come tratti poliuridinici, sono un tipico sottoprodotto dell'espressione del pegRNA nelle cellule.
"Il lavoro precedente ha dimostrato che La lega i tratti di poliuridina alle estremità 3' delle trascrizioni della RNA polimerasi III", ha affermato il gruppo di ricerca . "Abbiamo scoperto che La interagisce funzionalmente con le estremità 3′ dei pegRNA."
Sulla base di questi risultati, Adamson e colleghi hanno fuso la parte di La che lega i tratti di poliuridina ad una proteina di modifica primaria. Questa proteina, chiamata PE7, aveva un’efficienza di editing molto più elevata rispetto agli editor principali standard, con sottoprodotti molto bassi.
L'efficiente strumento di editor principale ha un potenziale clinico
Gli scienziati del Boston Children's Hospital, della Harvard Medical School e dell'Università della California hanno appreso dei risultati di Adamson e colleghi e volevano applicare PE7 alle cellule rilevanti per la malattia.
“Abbiamo poi valutato l’editing con PE7 su ulteriori target genomici, compresi quelli associati all’anemia falciforme ( HBB ), alla malattia da prioni ( PRNP ), all’ipercolesterolemia familiare ( PCSK9 ), alla terapia di trasferimento di cellule T adottive ( IL2RB ), all’infezione da HIV ( CXCR4 ) e Disturbo da carenza di CDKL5 (CDLK5) ”, hanno descritto Adamson e colleghi .
Come nel caso dell'esperimento precedente, l'editing su questi target genomici è stato sostanzialmente migliorato utilizzando PE7 rispetto agli editor principali standard.
“Sebbene l’esatto meccanismo (o i meccanismi) con cui La promuove il prime editing ed i confini entro i quali PE7 fornisce un miglioramento restano da chiarire completamente (ad esempio, attraverso ulteriori tipi di cellule, modalità di consegna e condizioni di editing), il nostro studio rappresenta un importante primo passo passo avanti nella comprensione di questo determinante cellulare chiave e nello sfruttamento della sua funzione per l’ottimizzazione”, hanno affermato i ricercatori.
"Questo lavoro è un bellissimo esempio di come sondare in profondità il funzionamento interno delle cellule possa portare ad intuizioni inaspettate che potrebbero produrre un impatto biomedico a breve termine", ha affermato il dottor Daniel Bauer , coautore dello studio e medico curante presso il Boston Children's Hospital. e ha concluso Donald S. Fredrickson, professore associato di pediatria presso la Harvard Medical School .
Cos'è uno schermo CRISPRi?
Una libreria di RNA guida (gRNA) mirati a diversi geni viene introdotta nelle cellule, insieme al sistema CRISPRi, una versione modificata del sistema CRISPR-Cas9 che consente un controllo preciso dell'espressione genica, senza influenzare la sequenza del DNA. I gRNA dirigono il complesso repressore Cas9 verso un gene bersaglio dove interferisce con la trascrizione, riducendo o silenziando completamente l'espressione genica. Ciò consente ai ricercatori di esplorare gli effetti del knockdown genetico sui fenotipi cellulari.
ENGLISH
While probing the inner workings of cells, Princeton University scientists unexpectedly boost prime editing efficiency.
Prime editing is the “new kid on the block” for genome editing, offering scientists precise control over how genome sequences are changed. Though novel, the technique has already been used widely in cancer research, to restore normal function in sickle cell disease patient’s cells and to efficiently insert large DNA segments in plants, among other applications.
"Prime editing is such an incredibly powerful genome-editing tool,” said Dr. Britt Adamson, assistant professor of molecular biology at Princeton University.
Still in its infancy compared to other more established genome-editing techniques, prime editing has one shortfall; while it’s incredibly precise and versatile, it can be slow, producing edits at a low efficiency.
Adamson and colleagues at Princeton have been exploring different approaches to tackle this drawback. In Nature, they share a new, more efficient prime editor.
Do unknown cellular processes aid or hinder prime editing?
Prime editors are molecular machines that consist of an engineered Cas9 variant that is fused to a reverse transcriptase enzyme. The Cas9 element is guided to the target site by a prime editing guide RNA, or pegRNA, which enables sequence-specific DNA binding and nickase activity, while the reverse transcriptase produces a DNA molecule encoding a desired mutation.
damson and Jun Yan, a graduate student in Adamson’s research group, hypothesized that unknown processes occurring in cells could potentially hinder or accelerate prime editing. “To identify cellular determinants of prime editing, we developed scalable prime editing reporters and performed genome-scale CRISPR-interference (CRISPRi) screens,” the researchers explained.
Yan decided that he would first engineer a cell line that emits green fluorescence when specific prime edits are inserted. Next, he systematically blocked the expression of proteins that are typically expressed in those cells and measured the fluorescence to assess which of those proteins affected the prime editing process.
Yan identified 36 cellular determinants of prime editing, and only one – a small RNA-binding protein called La – promoted prime editing. Under normal physiological conditions, La binds to certain DNA sequences that are found at the ends of RNA molecules and protects them from being degraded. These sequences, known as polyuridine tracts, are a typical byproduct of pegRNA expression in cells.
“Previous work has shown that La binds polyuridine tracts at the 3′ ends of RNA polymerase III transcripts,” the research team said. “We found that La functionally interacts with the 3′ ends of pegRNAs.”
Based on these findings, Adamson and colleagues fused the part of La that binds polyuridine tracts to a prime editing protein. This protein, called PE7, had a much higher editing efficiency than standard prime editors, with very low byproducts.
Efficient prime editor tool has clinical potential
Scientists at Boston Children's Hospital, Harvard Medical School and the University of California learned of Adamson and colleagues’ results and wanted to apply PE7 in disease-relevant cells.
“We next evaluated editing with PE7 at additional genomic targets, including ones associated with sickle cell disease (HBB), prion disease (PRNP), familial hypercholesterolaemia (PCSK9), adoptive T cell transfer therapy (IL2RB), HIV infection (CXCR4) and CDKL5 deficiency disorder (CDLK5),” Adamson and colleagues described.
As with their previous experiment, editing at these genomic targets was substantially improved using PE7 compared to standard prime editors.
“Although the exact mechanism (or mechanisms) by which La promotes prime editing and the boundaries within which PE7 provides improvement remain to be fully elucidated (for example, across additional cell types, delivery modalities and editing conditions), our study represents an important first step in understanding this key cellular determinant and exploiting its function for optimization,” the researchers said.
"This work is a beautiful example of how deeply probing the inner workings of cells can lead to unexpected insights that may yield near-term biomedical impact,” Dr. Daniel Bauer, a co-author of the study and attending physician at Boston Children’s Hospital, and the Donald S. Fredrickson, MD Associate Professor of Pediatrics at Harvard Medical School, concluded.
What is a CRISPRi screen?
A library of guide RNAs (gRNAs) targeting different genes is introduced to cells, along with the CRISPRi system, a modified version of the CRISPR-Cas9 system that enables precise control of gene expression, without affecting the DNA sequence. The gRNAs direct the Cas9-repressor complex to a target gene where it interferes with transcription, thereby reducing or completely silencing gene expression. This allows researchers to explore the effects of gene knockdown on cellular phenotypes.
Da:
https://www.technologynetworks.com/genomics/news/probing-the-inner-world-of-cells-provides-unexpected-boost-to-prime-editing-386037?utm_campaign=NEWSLETTER_TN_Breaking%20Science%20News&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz-8zYooHpYYGq7y-1jdx2oBmtvpzmrpMAe0iqeXjTehmlxeCOduuvioTJsmGOm6o9BRyEKQSJpNOQ0lbENkrx_6Qi1jfHx_G1ohC-dQmNgvNBh8iT7o&_hsmi=303930214&utm_content=303930214&utm_source=hs_email
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