Dal paziente alla capsula di Petri: modellazione della malattia con cellule staminali pluripotenti umane / From patient to petri dish: disease modeling with human pluripotent stem cells

Dal paziente alla capsula di Petri: modellazione della malattia con cellule staminali pluripotenti umane. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questo tipo di applicazione. / From patient to petri dish: disease modeling with human pluripotent stem cells. The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this type of application

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Susan Kimber è professoressa presso l'Università di Manchester (Regno Unito), dove negli ultimi 15 anni lei ed il suo laboratorio hanno lavorato sulle cellule staminali umane pluripotenti per applicazioni di ingegneria tissutale e modellizzazione delle malattie.

In questa intervista di ELRIG Research & Innovation (20–21 marzo 2024; Manchester, Regno Unito), impariamo di più sui modelli di malattia che Kimber e colleghi stanno sviluppando, sulle tecniche che utilizzano per analizzare questi modelli e sulle sfide che si presentano lungo il percorso.

Perché le cellule staminali pluripotenti umane sono una risorsa importante per modellare le malattie genetiche?

È essenziale utilizzare modelli umani per comprendere le malattie umane. Ci sono molte differenze tra gli animali – i mammiferi più comuni in laboratorio sono i roditori – e gli esseri umani. Sappiamo che il processo di scoperta dei farmaci è molto costoso e che spesso i fallimenti si verificano in parte perché i modelli animali non riflettono ciò che realmente accade nei pazienti umani. Pertanto, penso che sia importante scoprire cosa succede nelle cellule umane.

Su quali modelli di malattia stai lavorando?

Abbiamo sviluppato diversi modelli a partire da cellule staminali primitive riprogrammate da cellule del corpo come le cellule del sangue; queste sono chiamate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Abbiamo adattato modelli per la malattia monogenica renale – sviluppando tessuto renale da cellule staminali – e malattie di bassa statura, e attualmente stiamo lavorando su modelli per organoidi cerebrali e modelli 2D per neuroni umani. Nel mio laboratorio, Stephen Woods ha sviluppato un modello di piastra di crescita, che prevedeva il prelievo di cellule staminali pluripotenti e la loro differenziazione in un tipo di cellula mesenchimale prima di un'ulteriore differenziazione in condrociti ed un modello di cartilagine. Questo modello di cartilagine produce pellet duri di cartilagine, creando quella che chiamiamo "coltura dei pellet".

Che tipi di protocolli di differenziazione utilizzate?

Il processo di differenziazione è relativamente semplice; ci vuole solo tempo. Nel caso del modello della piastra di crescita, una volta ottenute le cellule stromali mesenchimali umane derivate da iPSC, queste vengono differenziate in un mezzo basale che contiene fattori di crescita, TGFβ e BMP, noti per migliorare la condrogenesi. C'è anche un elemento di sviluppo autologo all'interno di quel sistema una volta avviato. La coltura 3D risultante può quindi essere valutata attentamente utilizzando RNA-seq in massa e RNA-seq a cellula singola e confrontata con il tessuto degli arti fetali umani in uno studio collaborativo.

Quali tecniche utilizzate per identificare i primi cambiamenti nello sviluppo del tessuto fetale che potrebbero portare alla formazione di percorsi aberranti?

Utilizziamo principalmente RNA-seq e RNA-seq a cellula singola per confrontare il nostro modello con ciò che accade rispettivamente nell'arto fetale normale o nel rene fetale. Questo processo funge da fase di convalida del modello. Indaghiamo se nel nostro modello sono presenti anche molecole note per essere critiche nell'organo naturale; alcuni potrebbero essere realizzati in un momento particolare dello sviluppo, quindi controlleremo se la sequenza di sintesi delle molecole sarà quella che ci aspettiamo. Lo facciamo con impegno da molti anni, quindi sappiamo esattamente cosa aspettarci.

Il nostro pane quotidiano sono i dati qPCR e l'istologia. Per i dati RNA-seq, ora disponiamo in laboratorio di persone esperte in bioinformatica in grado di estrarre informazioni sui geni regolati in modo differenziale tra una linea cellulare malata – portatrice di una particolare mutazione – ed una linea non malata. Eseguiamo anche immunofluorescenza convenzionale, imaging confocale e imaging a foglio luminoso perché lavoriamo con modelli 2D, nonché con i modelli 3D di cui abbiamo discusso. È una combinazione di imaging, informatica, omica ed anche analisi delle proteine ​​come il western blotting. In futuro, potremmo eseguire un po' di spettrometria di massa e metabolomica, in particolare per il modello renale ed il modello cartilagineo.

È importante ricordare che gli esseri umani hanno background genetici diversi. Utilizziamo diverse iPSC derivate dai pazienti per garantire che i nostri modelli tengano conto di questa diversità. Induciamo anche mutazioni che causano malattie in linee di cellule staminali pluripotenti non affette. Così facendo, possiamo creare una coppia isogenica di linee in cui entrambe sono geneticamente identiche, tranne per il fatto che una ha la mutazione che causa la malattia e l'altra no. Quindi, quando osserviamo tutte quelle diverse linee e vediamo cambiamenti condivisi nei percorsi molecolari, è probabile che le differenze che stiamo osservando siano dovute alla mutazione della malattia e non ad altri geni.

Come possiamo utilizzare questi modelli per orientare lo sviluppo dei farmaci e quali sfide potrebbero sorgere?

Abbiamo trovato alcuni risultati piuttosto sorprendenti nella nostra valutazione dei nostri modelli. Nel nostro modello di piastra di crescita, stiamo producendo questi pellet di cartilagine e grazie all'RNA-seq sappiamo che ci sono potenziali bersagli farmacologici. Tuttavia, ci siamo imbattuti in un problema: come facciamo a inserire i nostri farmaci in quei pellet solidi? La penetrazione in un sistema organoide sarà difficile qualunque sia il sistema organoide, ma in particolare per la cartilagine. L'altro problema che abbiamo riscontrato in altri modelli è che, se guardiamo agli inibitori standard dei nostri bersagli farmacologici, non sono necessariamente così specifici come vorremmo che fossero. Quindi è stato piuttosto impegnativo cercare di identificare farmaci specifici per i nostri modelli di malattia.

Nel nostro modello di malattia renale, invece di cercare di inibire il fenotipo nell'organoide, abbiamo provato a manipolare un percorso chiave associato alla malattia per indurre il fenotipo in un organoide non affetto in modo da poter convalidare la causa del fenotipo della malattia. Naturalmente, ciò di cui abbiamo bisogno sono analisi funzionali, ed anche questo è impegnativo con questo tipo di modello di malattia. Ad esempio, dobbiamo provare a dimostrare che la progressione della condrogenesi ritorna a qualcosa di più simile a quello nel modello non affetto od alterare la struttura molecolare malformata dei tubuli renali e cercare surrogati della loro funzione di trasporto. Un modo per portare avanti questo approccio è utilizzare un reporter come un fluorocromo od una molecola bioluminescente sotto il controllo di una molecola critica nel percorso principale della malattia. Quindi possiamo progettare uno schermo del farmaco e se un farmaco fa illuminare questa molecola, allora abbiamo una lettura che suggerisce che il farmaco potrebbe essere utile per alleviare l'effetto della mutazione.

Qual è il futuro dei tuoi modelli?

Cercherò di non assumere troppi nuovi modelli! Siamo ora al punto in cui abbiamo alcuni potenziali bersagli farmacologici, quindi sto cercando di incoraggiare il settore biofarmaceutico a interessarsi a ciò che stiamo facendo e potenzialmente a metterci a disposizione alcuni degli inibitori che non sono ancora sul mercato .

Inoltre, i dottorandi del mio laboratorio stanno cercando di sviluppare screening dei farmaci. Abbiamo un utile test reporter nel modello della cartilagine, che dobbiamo utilizzare nelle nostre cellule staminali pluripotenti, e quindi configurarlo in un formato di screening farmacologico. Naturalmente, ci sono controlli antifarmaco commerciali là fuori che potremmo testare. Certamente, nel modello renale in cui abbiamo un canale ionico bersaglio, ci sono molti screening dei farmaci dal campo neurale che potremmo riposizionare nel rene per vedere se sono utili.

Abbiamo fatto 7 o 8 anni di ricerca per arrivare a questo punto, il che è stato entusiasmante ma anche impegnativo e costoso. Per condurre la ricerca abbiamo ricevuto principalmente finanziamenti europei o del Consiglio della ricerca, ma sarebbe bello se l'industria farmaceutica fosse più propensa a farsi coinvolgere un po' prima. Ciò può essere frustrante e, come nel caso di altre ricerche, se non otteniamo il finanziamento non possiamo svolgere il lavoro. Sarebbe molto vantaggioso avere al momento un input commerciale su alcuni di questi modelli.

ENGLISH

Susan Kimber is a Professor at the University of Manchester (UK), where for the past 15 years, she and her lab have been working on human pluripotent stem cells for tissue engineering applications and disease modeling.

In this interview from ELRIG Research & Innovation (20–21 March 2024; Manchester, UK), we learn more about the disease models Kimber and colleagues are developing, the techniques they use to analyze these models and the challenges that arise along the way.

Why are human pluripotent stem cells an important resource for modeling genetic diseases?

It’s essential to use human models to understand human disease. There are many differences between animals – the most common mammalian animals in the lab being rodents – and human beings. We know that the drug discovery pipeline is very expensive, and failures often occur in part because animal models do not reflect what actually happens in human patients. Therefore, I think it’s important to find out what happens in human cells.

Which disease models are you working on?

We have developed several models from primitive stem cells reprogrammed from cells of the body like blood cells; these are called induced pluripotent stem cells (iPSCs). We have adapted models for kidney monogenic disease – by developing kidney tissue from stem cells – and diseases of short stature, and we’re currently working on models for brain organoids and 2D models for human neurons. In my lab, Stephen Woods developed a growth plate model, which involved taking pluripotent stem cells and differentiating them into a mesenchymal cell type before further differentiation into chondrocytes and a cartilage model. This cartilage model produces hard pellets of cartilage, creating what we call a ‘pellet culture’.

What kinds of differentiation protocols do you use?

The process of differentiation is relatively simple; it just takes time. In the instance of the growth plate model, once we’ve got our human iPSC-derived mesenchymal stromal cells, they are differentiated in a basal medium that contains growth factors, TGFβ and BMP, that are known to enhance chondrogenesis. There’s an element of autologous development as well within that system once it’s initiated. The resulting 3D culture can then be evaluated carefully using bulk RNA-seq and single-cell RNA-seq and compared to human fetal limb tissue in a collaborative study.

What techniques do you use to identify early changes in fetal tissue development that may lead to the formation of aberrant pathways?

We primarily use RNA-seq and single-cell RNA-seq to compare our model to what happens in the normal fetal limb or fetal kidney, respectively. This process acts as a validation step for the model. We investigate if molecules known to be critical in the natural organ are also made in our model; some may be made at a particular time in development, so we would check if the sequence of synthesis of the molecules was as we expect. We have done that robustly for many years, so we know exactly what to expect.

Our bread and butter are qPCR data and histology. For RNA-seq data, we now have people in the lab who are skilled at bioinformatics who can extract information about the differentially regulated genes between a disease cell line – one carrying a particular mutation – and a non-disease line. We also do conventional immunofluorescence, confocal imaging and light-sheet imaging because we work with 2D models, as well as the 3D models we’ve been discussing. It’s a combination of imaging, informatics, omics and also protein analyses like western blotting. In the future, we may do some mass spectrometry and metabolomics, particularly for the kidney model and the cartilage model.

It’s important to remember that human beings have different genetic backgrounds. We use different patient-derived iPSCs to ensure our models account for this diversity. We also induce disease-causing mutations in unaffected pluripotent stem cell lines. In doing so, we can create an isogenic pair of lines where both are genetically identical except that one has the mutation that causes disease, and the other does not. Then, when we look at all those different lines and see shared changes in molecular pathways, it is likely that the differences that we’re seeing are due to the disease mutation and not due to other genes.

How can we use these models to inform drug development and what challenges may arise?

We found some quite surprising findings in our evaluation of our models. In our growth plate model, we’re making these cartilage pellets, and thanks to RNA-seq we know there are potential drug targets. However, we ran into a problem: how do we get our drugs into those solid pellets? Penetration in an organoid system is going to be difficult whatever the organoid system, but particularly for cartilage. The other issue that we’ve had in other models is that, if we look at off-the-shelf inhibitors of our drug targets, they’re not necessarily as specific as we would like them to be. So, it’s been quite challenging trying to identify specific drugs for our disease models.

In our kidney disease model, instead of trying to inhibit the phenotype in the organoid, we’ve tried to manipulate a key disease-associated pathway to induce the phenotype in an unaffected organoid so that we can validate the cause of the disease phenotype. Of course, what we need is functional assays, and that is also challenging with this kind of disease model. For instance, we must try to show that the progression of chondrogenesis reverts to something that’s more like that in the unaffected model or alter the malformed molecular patterning of the kidney tubules and look for surrogates of their transport function. One way of advancing this approach is to use a reporter such as a fluorochrome or bioluminescent molecule under the control of a critical molecule in the major disease-affected pathway. Then we can design a drug screen and if a drug causes this molecule to light up, then we have a read out suggesting that drug may be helpful in alleviating the effect of the mutation.

What’s next for your models?

I’m going to try not to take on too many new models! We’re now at the point where we have some potential drug targets, so I’m trying to encourage biopharma to become interested in what we’re doing and potentially make available to us some of the inhibitors that are not on the market just yet.

Additionally, the postdocs in my lab are trying to develop drug screens. We have a useful reporter assay in the cartilage model, which we need to use in our pluripotent stem cells, and then set it up in a drug screen format. Of course, there are commercial drug screens out there that we could test. Certainly, in the kidney model where we have an ion channel target, there are quite a lot of drug screens from the neural field that we could reposition over into the kidney to see if they’re useful.

We have done 7 or 8 years of research to get to this point, which has been exciting but also challenging and expensive. We’ve had mostly European or Research Council funding to conduct the research, but it would be nice if pharma was more inclined to get involved a bit earlier. This can be frustrating and as with other research, if we don’t get the grant, we can’t do the work. It would be very beneficial to have commercial input into some of these models at the present time.

Da:

https://www.biotechniques.com/cell-and-tissue-biology/from-patient-to-petri-dish-disease-modeling-with-human-pluripotent-stem-cells/