High-Throughput Platform for Fluorescence Image-Based Neurite Outgrowth Analysis / Piattaforma ad alto rendimento per l'analisi della crescita dei neuriti basata su immagini di fluorescenza

High-Throughput Platform for Fluorescence Image-Based Neurite Outgrowth Analysis. The procedure of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this type of application. / Piattaforma ad alto rendimento per l'analisi della crescita dei neuriti basata su immagini di fluorescenza. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in qusto tipo di aplicazione. 

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Generalized workflow for immunofluorescence-based automated neurite outgrowth assays. / Flusso di lavoro generalizzato per test automatizzati di crescita dei neuriti basati sull'immunofluorescenza.

Automated solution for quantitative neurite outgrowth analysis of labeled iPSC-derived and primary neuron culture models.

Abstract 

The evaluation of neurite outgrowth using high-throughput image-based analysis provides an essential tool for neurobiologists to advance basic, translational, and clinical research in neuroscience. In this application note, we introduce the Agilent BioTek Gen5 neurite outgrowth module for flexible, automated, multichannel analysis of neurite outgrowth. The module is compatible across Agilent BioTek imaging instruments to provide a single platform solution for neurite outgrowth assays. Neurite outgrowth analysis capabilities are demonstrated through proof-ofprinciple outgrowth evaluations for both iPSC-derived and primary neuron culture models. Automated image collection and analysis was performed in a high-density microplate format that enabled dose–response analysis of neuron cultures with multiple neurite outgrowth characteristics. Fluorescent immunocytochemistrybased evaluations yielded sensitive and specific detection of both stimulatory and inhibitory effects on outgrowth parameters in both neuron culture models.

Introduction 

Neurons extend cellular outgrowths in a coordinated set of developmental processes that serve to both establish and maintain the cellular connections essential to the nervous system’s communications network. These early outgrowth processes, termed neurites, are developing dendrite and axon compartments that will be responsible for incoming and outgoing neurotransmission, respectively. In vitro neurite outgrowth models have provided an essential platform for determining the molecular and cellular mechanisms that underlie both normal and aberrant neuronal development. Furthermore, neurite outgrowth plays a role in key neurological health research areas focused on leveraging emerging stem cell-derived models for developmental neurotoxicity testing, neuroregeneration, and neurodegeneration.

Models used for in vitro neurite outgrowth evaluations have historically been acquired from primary murine tissues, and immortalized neuronal-like cell lines typically derived from malignant tissue sources. Although both model types have been essential for foundational research, these models present limitations for scalability, relevance, and predictive power in neurological research. Comparatively, induced pluripotent stem cell-derived (iPSC-derived) neuronal models have a compelling profile for both translational and clinical research owing to their established relevance and scalability. Furthermore, iPSC-derived cell amenability to genome editing techniques paired with the ability to apply human-derived genetic backgrounds provide powerful handles for neuronal disease phenotyping and personalized medicine.

Neurite outgrowth is evaluated across neuronal culture models using many imaging techniques, including label-free methods, live-cell stains, membrane dyes, and antibody-based immunofluorescence. Of these, antibody-based staining is often relied upon for neuron detection, as it provides a level of specificity that cannot be readily matched by alternative methods. Antibody-based staining is clearly required for neurite outgrowth analysis in complex culture models, such as coculture or triculture model systems. However, specificity can also be important for outgrowth in models where neuronal differentiation is only occurring in a subpopulation of cultured cells through addition or exclusion of media factors. Primary cortical cultures also present mixed cell populations that benefit from antibody-based analysis for specificity, although tissue age and media components can be leveraged to limit the presence and expansion of nonneuronal cell populations. iPSC-derived neuronal cultures, such as the iCell GlutaNeurons used in this study, can provide a high degree of pure neuronal populations, but antibodybased evaluations are often still relied upon to establish neuronal marker expression and outgrowth.

The Agilent BioTek Gen5 neurite outgrowth module, used with an Agilent BioTek cell imaging multimode reader, provides a flexible and powerful system to support neurite outgrowth research.This study demonstrates neuron culture outgrowth analysis using advanced immunohistochemistry techniques that focus on multiplexed fluorescent analysis of two commonly used culture models for neurite outgrowth. We detail how automation of sample preparation steps, image collection, and image analysis can facilitate the sensitive, high-throughput evaluation of neurite outgrowth while minimizing user intervention and effort. Positive and negative chemical modulators of neurite outgrowth are evaluated to demonstrate the sensitivity and performance of the platform to detect changes across multiple parameters relevant for neurite outgrowth assays

Experimental 

Materials Chemicals 

All chemicals were purchased from Sigma unless otherwise noted, including outgrowth effectors blebbistatin (p/n B0560), 6BIO (p/n B1686), and triptolide (p/n T3652). Staurosporine was purchased from Tocris Bioscience (p/n 1285)

Cell culture iCell GlutaNeurons (FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., p/n R1061) cryopreserved iPSC-derived neurons were cultured in BrainPhys Neuronal Medium (StemCell Technologies, p/n 05790) supplemented with iCell Neural Supplement B (iCell kit component), iCell Nervous System Supplement (iCell kit component), N-2 Supplement (Gibco, p/n 17502048), and laminin (Sigma, L2020). Primary mouse cortical neurons (Gibco, p/n A15586) were cultured in NeuroCult Neuronal Plating Medium (StemCell Technologies, p/n 05713) and supplemented with NeuroCult SM1 neuronal supplement (StemCell Technologies, p/n 05711), GlutaMAX supplement (Gibco, 35050061), L-glutamate (Sigma, p/n 1251), and laminin (Sigma, p/n L2020). ICell GlutaNeuron and primary mouse cultures were plated on Greiner glass bottom 96-well microplates (Greiner, p/n 655892) for outgrowth assays. Microplates for iCell GlutaNeuron cultures were first coated with poly-L-ornithine solution (PLO: Sigma, A-004-M), followed by complete media supplemented with laminin. Microplates for mouse cortical neurons were coated with poly-D-lysine (Gibco, p/n A3890401)

Immunohistochemistry

 Anti-β-tubulin III antibody (β-tubulin) was purchased from Sigma (p/n T8578) and anti-MAP2 antibody (MAP2) was purchased from Invitrogen (p/n PA1-10005). Goat-anti-mouse Alexa 633 secondary antibody was purchased from Thermo Fisher Scientific (p/n A21052) and goat-anti-chicken Alexa 488 secondary antibody was purchased from Invitrogen (p/n A11039). Bovine serum albumin (BSA) was purchased from Sigma (p/n A3294).

Instrumentation

 The Agilent BioTek Cytation 5 cell imaging multimode reader with wide field of view camera was used for all image acquisition and was outfitted with a 20x phase contrast objective (p/n 1320517) and the following filter cubes: DAPI (p/n 1225100), GFP (p/n 1225101), CY5 (p/n 1225105), and LAF (p/n 1225010). The Agilent BioTek MultiFlo FX multimode dispenser with the Agilent BioTek Automated Media Exchange (AMX) module was used for plate washes between immunohistochemistry steps. The Gen5 neurite outgrowth module was used for all image analysis and data plotting.

Methods 

Cell culture 

Culture procedures followed manufacturer recommendations for iCell GlutaNeurons and cryopreserved mouse cortical neurons. Microplates were prepared for culture the day before plating. Plates were first coated overnight at room temperature with poly-L-ornithine (iCell GlutaNeurons) or poly-D-lysine (mouse cortical neurons). Coated plates were rinsed five times with sterile phosphate-buffered saline (PBS) and incubated in a humidified tissue culture incubator (at 37 °C and 5% CO2 ) for at least one hour before plating cells with complete media (mouse cortical neurons), or complete media plus laminin (iCell GlutaNeurons). iCell GlutaNeuron and cryopreserved mouse cortical neurons were thawed and plated following manufacturer protocol recommendations. Live cell estimations were performed with trypan blue exclusion method. Cells were plated at a density of approximately 10,000 live cells per well. To promote even cell dispersal across the well, plates were allowed to rest at room temperature for approximately 30 minutes to permit cell adhesion before transferring to a tissue culture incubator. To minimize evaporative effects across the plate, regions between wells were partially filled with sterile water. For mouse cortical cultures, a 50% media exchange was performed approximately two hours after initial plating. 

After 24 hours of initial outgrowth, a dilution series of outgrowth effectors were applied to both iCell GlutaNeuron and mouse primary cortical culture in a 50% media exchange. For iCell GlutaNeurons only, an additional 50% media exchange was performed 48 hours later (72 hours following plating) with maintenance of final drug concentrations.

Immunohistochemistry processing 

After five days in vitro (120 hours), cultures were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature. Following fixation, 96-well microplates were washed with PBS with 0.05% Tween-20 (PBST) using the MultiFlo FX with the AMX module for five cycles (150 μL per cycle, 30 μL/second). Cultures were permeabilized and blocked for one hour at room temperature with a PBS solution containing 0.1% TritonX-100 and 3% BSA. Permeabilized cultures were incubated overnight at 4 °C with primary antibodies diluted at 1:5,000 in a PBST solution with 3% BSA. Following overnight incubation in primary antibody, plates were washed five times with the MultiFlo FX with AMX module. Secondary antibodies were applied at a 1:500 dilution in PBST containing 1% BSA and 1 μM DAPI nuclear counterstain and incubated for two hours at room temperature. Following secondary antibody incubation, plates were washed five times with a MultiFlo FX with AMX module with PBST + 0.05% sodium azide. 

Image capture and processing 

Multichannel fluorescence images were captured at 20x magnification in widefield mode in a 3 x 3 image montage in the center of each well across the 96-well plate. Focus was achieved using the laser autofocus method. Image tiles were stitched to generate a single large image for neurite outgrowth analysis. Stitched images were background subtracted (100 μm rolling ball) before analysis for optimal visualization of neuronal processes.

Image analysis 

Default settings of the Gen5 neurite outgrowth module provided a starting point for soma and neurite detection and were further optimized. For best results with immunolabeled cultures, it is recommended that both immunostaining and nuclear staining signals are used for soma detection. Optimal values for the parameters will vary based on experimental conditions, and users are expected to evaluate and adjust these parameters as needed.

Data analysis and fitting 

Gen5 microplate reader and imager software was used for all data plotting and fitting. Dose–response relationships were fit with four-parameter fits and Z-scores were calculated in Gen5 using the difference between the treatment mean and control mean expressed in multiples of the standard deviation of control. In the Gen5 software syntax, the following formula was applied in a transformation step to calculate the Z-score for each outgrowth parameter: (X-MEAN(CTL1))/SD(CTL1)

Results and discussion 

Neurite outgrowth assay overview Neurite outgrowth assays are relied upon across neuroscience model systems to evaluate the characteristics of neuron growth and extension of processes in both compromised and healthy states, as well as in response to drug treatment. In this study, two cell models frequently evaluated through neurite outgrowth assays, mouse cortical culture, and iPSC-derived neurons, were explored in a proof-of-concept demonstration of the Gen5 neurite outgrowth module.

A general neurite outgrowth assay schematic for immunohistochemistry is shown in Figure 1. Cultures were plated on high-density microplates and processed for evaluation after five days of outgrowth. Multiplexed immunohistochemistry was conducted using two markers for neurite outgrowth and a nuclear counterstain. The MultiFlo FX multimode dispenser with AMX was used for gentle plate washes between immunohistochemistry steps to both maximize efficiency and minimize potential damage from manual pipetting. Multichannel fluorescent images were automatically captured on the Cytation 5 cell imaging multimode reader across the plate and analyzed with Gen5 neurite outgrowth module. Multiple types of analysis, including dose–response analysis shown in Figure 1, can be performed in Gen5 software to evaluate treatment effects on outgrowth.

Image collection and processing for neurite outgrowth analysis 

Image-based neurite outgrowth measurements used multichannel fluorescent immunocytochemistry to evaluate two neurite outgrowth markers and nuclear counterstain. A 20x objective was used for all image acquisition and images were tiled to sample a large region for analysis. Montages were stitched together automatically to evaluate a representative central FOV in the well. Images were next background subtracted to aid in visualization of neuronal processes. Background subtraction is an optional step that is not required for analysis but can help optimize visualization of neurites for display of the analysis results. Background subtraction yielded relatively minor improvements with these cultures as observed by comparing center and right panels. Individual fluorescent channels are shown with a composite overlay. In maturing neurons, MAP2 antibody labeling is primarily localized to dendrites, whereas the β-tubulin antibody labels both axonal and dendritic compartments. This compartmentation can be appreciated in the overlay image where MAP2-positive neurites are also β-tubulin positive, but many more processes, potentially the developing axonal compartments, are labeled only by the β-tubulin antibody.

Multichannel fluorescent image-based neurite outgrowth analysis

 Multichannel montaged images were processed for neurite outgrowth analysis for both β-tubulin and MAP2 staining stepwise. Gen5 software neurite outgrowth module supports analysis on a single fluorescent channel (e.g., neuron staining) or can combine a second fluorescent channel (e.g., DAPI staining) to optimize detection. For neurite analysis with immunolabeled cultures, it is recommended that both nuclear staining and immunolabeling are used together for optimal results. The combination of nuclear staining with immunolabeling helps optimize soma detection in several aspects. First, many neuronal antibodies, including both β-tubulin and MAP2 antibodies, strongly identify the perinuclear somatic region, but are weak or absent in the nucleus itself. Nuclear labels effectively fill these immunolabeling voids for improved soma segmentation. Second, the Gen5 neurite outgrowth module uses nuclear signals to help separate clusters of neuronal somas and can therefore provide more accurate soma counts. 

Third, Gen5 neurite outgrowth module includes built-in options designed to leverage nuclear signals to limit the detection of nonneuronal nuclei through a minimum percent overlap criteria between the nuclear and somatic staining signals. Finally, nuclear staining provides a means of setting a distance limit for how far the soma signal can extend from the nucleus, termed the nucleus/soma distance in Gen5 neurite outgrowth module. This feature assists in defining the boundary of where the soma ends and the neurite begins and can be adjusted according to user requirements. Soma identification, was identified with this purpose-built combination of Gen5 neurite outgrowth module features to accurately identify viable neuronal somas for analysis.

Following soma detection optimization, neurite detection was next optimized. Gen5 neurite outgrowth module neurite filtering features provide the ability to include or disregard detected neurites according to several criteria. First, users can opt to include only neurites that are connected to soma on the image for analysis. Electing this filtering option will discard fragmented neurites and neurites that originate from soma that are not within the image. The neurite skeletons were filtered to only include neurites connected to somas. However, it should be noted that the images are only a portion of the entire field that was analyzed, and it is expected that some neurites displayed connect to soma that are not visible within the displayed region.

 Additional filtering options permit users to set minimal requirements to include neurites for analysis, such as minimal acceptable lengths for fragmented neurites, neurites extending directly from a soma, and terminal neurite branches. 

Neuron outgrowth response to inhibitors and enhancers of neurite outgrowth

 As a proof-of-principle demonstration, outgrowth of cryopreserved iPSC-derived neuron and primary mouse cortical neuron cultures were evaluated in response to treatment with four drugs previously reported as potential enhancers or inhibitors of neurite outgrowth. Cells were plated at a density of 10,000 live cells (determined via postthaw trypan blue cell counting) per well in a 96-well plate format for outgrowth evaluation. For iCell GlutaNeurons, a live cell percentage of approximately 65% was observed at thaw and total live-cell yields were consistent with the manufacturer estimates. For cryopreserved mouse ECNs, a live cell percentage of approximately 50% was observed at thaw, also in line with the manufacturer's estimates.

At 24 hours post-thaw (culture day 1), 50% of the neuron culture media was removed and replaced with a dilution series of each of the four drugs at the final concentrations. After 48 hours of drug exposure (culture day 3), an additional 50% media exchange was performed for iCell GlutaNeurons (while maintaining final drug concentrations), in alignment with the manufacturer's recommendations for media refreshment schedule. Media exchanges between culture days 1 and 5 were not performed for mouse ECN culture, per media manufacturer's recommendation.

 Neuron cultures were fixed on culture day 5 and evaluated for neurite outgrowth with fluorescent immunostaining and nuclear staining. For these cultures, detection settings were optimized to include cells that met nuclear and soma minimum size criteria that are consistent with characteristics of neurons that were viable at the time of fixation. The Gen5 neurite outgrowth module detection settings used are detailed. Detection parameters are flexible and intended to provide users the ability to optimize analysis as desired across a range of expected cell characteristics.

iPSC-derived neuron culture response to outgrowth stimulation and inhibition 

Neuron culture outgrowth in response to treatment was first evaluated for iPSC-derived cultures. Results of the Gen5 neurite outgrowth module analysis are automatically reported for both image-level metrics (e.g., total outgrowth length in the image), as well as cell-level average values (e.g., per-cell average neurite length). Analysis was performed independently for each antibody, and outgrowth dose– response curves for β-tubulin evaluation and MAP2 staining evaluation are presented for several outgrowth parameters. 

For iPSC-derived neurons, responses for each drug were consistent with previous reports of the ability of the drugs to enhance (staurosporine and blebbistatin) or reduce (6BIO and triptolide) neurite outgrowth. However, blebbistatin produced a relatively small (approximately 20%) increase in total outgrowth for iCell GlutaNeurons, compared to staurosporine. Staurosporine promoted neurite outgrowth until the highest concentrations tested, where significant cell death was abruptly observed, consistent with previous reports. To estimate the drug effect through fitting, the highest drug concentration for staurosporine was omitted from the fourparameter fit.

As opposed to the two stimulatory drugs tested, both 6BIO and triptolide demonstrated substantial reductions in neurite outgrowth with typical four-parameter dose–response relationships. In addition to reductions in total outgrowth measured at the image-level, the average per-cell neurite length, branch count, and neurite number were all reduced with application of both 6BIO and triptolide. The results obtained with β-tubulin and MAP2 staining evaluations largely indicated general agreement on neurite outgrowth properties with some exceptions. For triptolide, both staining evaluations provided similar outgrowth inhibition and dose–response characteristics. For 6BIO, however, β-tubulin staining indicated a greater degree of inhibition compared to MAP2. It is possible that this difference indicates that 6BIO has a greater inhibitory effect on putative axonal outgrowth compared to dendritic outgrowth.

When cell count values are consistent, total image level outgrowth reflects the average outgrowth of any individual cell. However, if cell numbers are changing, such as with loss of neuron viability, it is often informative to also evaluate the per-cell outgrowth average. In addition to image-level results for total outgrowth, the Gen5 neurite outgrowth module calculates the per-cell average neurite outgrowth values using the soma count. For these inhibitory treatments, both the per-cell average and image average outgrowth were in general agreement, indicating the effect on outgrowth occurred at the per-cell level and not only at the image level. This is consistent with the specific inhibitory effect of 6BIO and triptolide on neurite outgrowth and not simply a reflection of a general loss of cell viability.

Cryopreserved mouse cortical culture outgrowth response evaluation

Parallel investigation of outgrowth was undertaken for cryopreserved primary mouse cortical cultures, and was evaluated over the same time course, drug concentration series, and immunohistochemistry approach. It shows example images of neurite outgrowth evaluated in control wells and wells treated with positive and negative effectors as indicated after five days of culture. To simplify comparison against iPSC-derived cultures, neurite outgrowth results are presented only for β-tubulin staining. 

Blebbistatin produced a large increase in neurite outgrowth in mouse cortical cultures, demonstrated by dose–response evaluations across multiple parameters using both Gen5 neurite outgrowth module analysis and cellaveraged analysis. Interestingly, blebbistatin was the only drug that demonstrated a dose-dependent increase in the number of somas. As blebbistatin inhibits myosin II implicated in both apoptosis and neuronal outgrowth, it is possible that blebbistatin is protective against some of the apoptotic cell loss related to primary cell culture cryopreservation.

Staurosporine, however, demonstrated a complex effect in primary mouse neurons that differed from the relatively robust and consistent outgrowth enhancement observed for iPSC-derived neurons. Cell viability was reduced, as soma counts, total outgrowth, and total branches all decreased with increasing concentrations. However, the cells that did survive at higher staurosporine concentrations exhibited a greater average number of outgrowths and branches, concurrent with a shorter measured average length. This combination of effects suggests staurosporine may promote neurite protrusion in this model, but not overall length. Although iPSC-derived neuron outgrowth was notably inhibited by triptolide, outgrowth of mouse ECN-cultured neurons was much less sensitive to triptolide as reflected in the reduced effect size and comparatively shifted dose– response curve across multiple measures of outgrowth. Although triptolide resulted in a relatively small decrease in total neurite length at the highest concentrations tested, the average length and branching count of the surviving cells was unchanged; the absence of average per-cell effects suggests a general decrease in neuron viability that was consistent with the observed decrease in soma counts.

Comparative summary of iPSC-derived and primary mouse neuron outgrowth 

It provides a summary of the Gen5 software neurite outgrowth module measurements for both iPSC-derived and mouse neuron culture models. Control well averages are indicated for each culture type, as well as percent effect size (relative to control well values) and IC/EC50 values across outgrowth metrics. For most treatments, outgrowth metric responses were adequately fit with four-parameter dose– response relationships and IC/EC50 values automatically calculated in the Gen5 software for imaging and microscopy. In some cases, however, plateaus for concentrationdependent effects were not well resolved. In those cases, reported effect size and IC/EC50 values were instead reported at 50% of the maximal response of the highest test concentration using fit interpolation values in the Gen5 software.

For each metric, Z-scores were calculated in Gen5 software to determine whether treatment means were significantly different from the control mean for each outgrowth parameter. Outgrowth parameters with Z-score absolute values greater than two across multiple consecutive concentrations were considered to have a parameter mean that was significantly different from control. Effect size and IC/EC50 values are included for treatments with significant responses. Outgrowth parameters that did not result in significant differences from control are indicated with “ns.“

 In addition to the default parameters measured by the Gen5 neurite outgrowth module, an additional parameter calculating the percentage of neurons that had outgrowth is included. For this percentage evaluation, only cells that exhibited multiple (> 1) neurite counts were considered to have significant outgrowth and included in the percentage. This parameter was generated using the neurite module “Group Neurons” functionality to count cells and create subpopulations based on different available measurements. Neuron grouping criteria are flexible to permit user-specified groupings based on multiple parameters such as soma size, signal intensity, or neurite count.

Conclusion 

Automated solutions for image-based neurite outgrowth are essential to enable rapid and high-throughput neurobiology investigations at scale. The Agilent BioTek Gen5 neurite outgrowth module described here provides a flexible and powerful solution that leverages the advantages of an automated, high-throughput system for multimodal image analysis. A key feature of the Gen5 neurite outgrowth module for neurite outgrowth assays is the flexibility of multichannel analysis across multiple fluorescence channels and modalities to support a broad range of neurite outgrowth approaches. 

This study has provided a proof-of-principle demonstration for neurite outgrowth analysis of both iPSC-derived and primary mouse neuron culture models relevant to a broad range of neurobiology research areas. We have focused on evaluating these key neurite outgrowth models in a commonly used immunohistochemistry-based approach to demonstrate the usability and performance of the platform. Agilent BioTek Gen5 microplate reader and imager software integrated the automated image capture, processing, and neurite outgrowth detection within a single interface and in a streamlined stepwise process. Data plotting and fitting capabilities of the Gen5 microplate reader and imager software readily transformed the neurite image detection results into quantitative analysis of the treatment effects. In both culture models tested, significant dose–response effects were measured across multiple parameters of neurite outgrowth for several modulators of neuronal outgrowth.

ITALIANO

Soluzione automatizzata per l'analisi quantitativa della crescita dei neuriti di modelli di coltura di neuroni primari e derivati ​​da iPSC marcati.

Riassunto

La valutazione della crescita dei neuriti utilizzando l'analisi basata su immagini ad alto rendimento fornisce uno strumento essenziale per i neurobiologi per far avanzare la ricerca di base, traslazionale e clinica nelle neuroscienze. In questa nota applicativa presentiamo il modulo di crescita dei neuriti Agilent BioTek Gen5 per l'analisi flessibile, automatizzata e multicanale della crescita dei neuriti. Il modulo è compatibile con tutti gli strumenti di imaging Agilent BioTek per fornire una soluzione a piattaforma unica per i test sulla crescita dei neuriti. Le capacità di analisi della crescita dei neuriti sono dimostrate attraverso valutazioni di prova della crescita dei principi sia per i modelli di coltura di neuroni primari che per quelli derivati ​​da iPSC. La raccolta e l'analisi automatizzate delle immagini sono state eseguite in un formato di micropiastra ad alta densità che ha consentito l'analisi dose-risposta di colture di neuroni con molteplici caratteristiche di crescita dei neuriti. Le valutazioni basate sull'immunocitochimica fluorescente hanno prodotto un rilevamento sensibile e specifico degli effetti sia stimolatori che inibitori sui parametri di crescita in entrambi i modelli di coltura neuronale.

Introduzione

I neuroni estendono le escrescenze cellulari in una serie coordinata di processi di sviluppo che servono sia a stabilire che a mantenere le connessioni cellulari essenziali per la rete di comunicazioni del sistema nervoso. Questi primi processi di crescita, chiamati neuriti, stanno sviluppando compartimenti dendritici ed assoni che saranno responsabili rispettivamente della neurotrasmissione in entrata e in uscita. I modelli di crescita dei neuriti in vitro hanno fornito una piattaforma essenziale per determinare i meccanismi molecolari e cellulari che sono alla base dello sviluppo neuronale sia normale che aberrante. Inoltre, la crescita dei neuriti svolge un ruolo nelle principali aree di ricerca sulla salute neurologica focalizzate sullo sfruttamento di modelli emergenti derivati ​​​​da cellule staminali per test di neurotossicità dello sviluppo, neurorigenerazione e neurodegenerazione.

I modelli utilizzati per le valutazioni della crescita dei neuriti in vitro sono stati storicamente acquisiti da tessuti murini primari e linee cellulari immortalizzate di tipo neuronale tipicamente derivate da fonti di tessuto maligno. Sebbene entrambi i tipi di modelli siano stati essenziali per la ricerca fondamentale, questi modelli presentano limitazioni in termini di scalabilità, pertinenza e potere predittivo nella ricerca neurologica. In confronto, i modelli neuronali derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte (derivati ​​da iPSC) hanno un profilo convincente sia per la ricerca traslazionale che clinica grazie alla loro rilevanza e scalabilità consolidate. Inoltre, la disponibilità delle cellule derivate da iPSC alle tecniche di modifica del genoma, abbinata alla capacità di applicare background genetici di derivazione umana, forniscono potenti strumenti per la fenotipizzazione delle malattie neuronali e la medicina personalizzata.

La crescita dei neuriti viene valutata attraverso modelli di colture neuronali utilizzando molte tecniche di imaging, inclusi metodi senza etichetta, colorazioni di cellule vive, coloranti di membrana e immunofluorescenza basata su anticorpi. Di questi, per il rilevamento dei neuroni si fa spesso affidamento sulla colorazione basata su anticorpi, poiché fornisce un livello di specificità che non può essere facilmente eguagliato da metodi alternativi. La colorazione basata su anticorpi è chiaramente necessaria per l'analisi della crescita dei neuriti in modelli di coltura complessi, come i sistemi modello di cocoltura o tricoltura. Tuttavia, la specificità può anche essere importante per la crescita nei modelli in cui la differenziazione neuronale avviene solo in una sottopopolazione di cellule in coltura attraverso l'aggiunta o l'esclusione di fattori mediali. Le colture corticali primarie presentano anche popolazioni cellulari miste che beneficiano dell'analisi basata sugli anticorpi per la specificità, sebbene l'età dei tessuti edi componenti dei media possano essere sfruttati per limitare la presenza e l'espansione delle popolazioni cellulari non neuronali. Le colture neuronali derivate da iPSC, come gli iCell GlutaNeurons utilizzati in questo studio, possono fornire un elevato grado di popolazioni neuronali pure, ma spesso si fa ancora affidamento sulle valutazioni basate sugli anticorpi per stabilire l'espressione e la crescita dei marcatori neuronali.

Il modulo di crescita dei neuriti Agilent BioTek Gen5, utilizzato con un lettore multimodale di imaging cellulare Agilent BioTek, fornisce un sistema flessibile e potente per supportare la ricerca sulla crescita dei neuriti. Questo studio dimostra l'analisi della crescita delle colture neuronali utilizzando tecniche immunoistochimiche avanzate che si concentrano sull'analisi fluorescente multiplex di due comunemente modelli di coltura utilizzati per la crescita dei neuriti. Descriviamo in dettaglio come l'automazione delle fasi di preparazione del campione, della raccolta delle immagini e dell'analisi delle immagini può facilitare la valutazione sensibile ed ad alto rendimento della crescita dei neuriti riducendo al minimo l'intervento e lo sforzo dell'utente. I modulatori chimici positivi e negativi della crescita dei neuriti vengono valutati per dimostrare la sensibilità e le prestazioni della piattaforma nel rilevare cambiamenti su più parametri rilevanti per i test di crescita dei neuriti

Sperimentale

Materiali Chimici

Tutte le sostanze chimiche sono state acquistate da Sigma se non diversamente specificato, compresi gli effettori della crescita blebbistatina (codice B0560), 6BIO (codice B1686) e triptolide (codice T3652). La staurosporina è stata acquistata da Tocris Bioscience (codice articolo 1285)

Coltura cellulare iCell GlutaNeurons (FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., p/n R1061) neuroni derivati ​​da iPSC crioconservati sono stati coltivati ​​in BrainPhys Neuronal Medium (StemCell Technologies, p/n 05790) integrato con iCell Neural Supplement B (componente del kit iCell), iCell Supplemento per il sistema nervoso (componente del kit iCell), supplemento N-2 (Gibco, codice articolo 17502048) e laminina (Sigma, L2020). Neuroni corticali primari di topo (Gibco, p/n A15586) sono stati coltivati ​​in NeuroCult Neuronal Plating Medium (StemCell Technologies, p/n 05713) e integrati con il supplemento neuronale NeuroCult SM1 (StemCell Technologies, p/n 05711), supplemento GlutaMAX (Gibco, 35050061), L-glutammato (Sigma, codice articolo 1251) e laminina (Sigma, codice articolo L2020). ICell GlutaNeuron e colture primarie di topo sono state piastrate su micropiastre a 96 pozzetti con fondo in vetro Greiner (Greiner, codice articolo 655892) per i test di crescita. Le micropiastre per le colture iCell GlutaNeuron sono state inizialmente rivestite con una soluzione di poli-L-ornitina (PLO: Sigma, A-004-M), seguita da terreni completi integrati con laminina. Micropiastre per neuroni corticali di topo sono state rivestite con poli-D-lisina (Gibco, codice A3890401)

Immunoistochimica

 L'anticorpo anti-β-tubulina III (β-tubulina) è stato acquistato da Sigma (codice T8578) e l'anticorpo anti-MAP2 (MAP2) è stato acquistato da Invitrogen (codice PA1-10005). L'anticorpo secondario Alexa 633 anti-topo di capra è stato acquistato da Thermo Fisher Scientific (codice A21052) e l'anticorpo secondario Alexa 488 anti-pollo di capra è stato acquistato da Invitrogen (codice A11039). L'albumina sierica bovina (BSA) è stata acquistata da Sigma (codice A3294).

Strumentazione

 Per l'acquisizione di tutte le immagini è stato utilizzato il lettore multimodale di imaging cellulare Agilent BioTek Cytation 5 con telecamera ad ampio campo visivo ed era dotato di un obiettivo per contrasto di fase 20x (codice articolo 1320517) e dei seguenti cubi filtro: DAPI (codice articolo 1225100), GFP (codice 1225101), CY5 (codice 1225105) e LAF (codice 1225010). Il dispensatore multimodale Agilent BioTek MultiFlo FX con il modulo Agilent BioTek Automated Media Exchange (AMX) è stato utilizzato per i lavaggi delle piastre tra le fasi di immunoistochimica. Il modulo di crescita dei neuriti Gen5 è stato utilizzato per tutte le analisi delle immagini ed il tracciamento dei dati.

Metodi

Coltura cellulare

Le procedure di coltura hanno seguito le raccomandazioni del produttore per iCell GlutaNeurons e per i neuroni corticali di topo crioconservati. Le micropiastre sono state preparate per la coltura il giorno prima della piastratura. Le piastre sono state prima rivestite durante la notte a temperatura ambiente con poli-L-ornitina (iCell GlutaNeurons) o poli-D-lisina (neuroni corticali di topo). Le piastre rivestite sono state sciacquate cinque volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sterile e incubate in un incubatore per colture di tessuti umidificato (a 37 °C e 5% di CO2) per almeno un'ora prima di piastrare le cellule con terreni completi (neuroni corticali di topo), o supporto completo più laminina (iCell GlutaNeurons). iCell GlutaNeuron e i neuroni corticali di topo crioconservati sono stati scongelati e placcati seguendo le raccomandazioni del protocollo del produttore. Le stime delle cellule vive sono state eseguite con il metodo di esclusione del trypan blue. Le cellule sono state piastrate ad una densità di circa 10.000 cellule vive per pozzetto. Per promuovere una dispersione cellulare uniforme nel pozzetto, le piastre sono state lasciate riposare a temperatura ambiente per circa 30 minuti per consentire l'adesione cellulare prima del trasferimento in un incubatore per coltura tissutale. Per ridurre al minimo gli effetti di evaporazione attraverso la piastra, le regioni tra i pozzetti sono state parzialmente riempite con acqua sterile. Per le colture corticali di topo, è stato eseguito uno scambio del mezzo di comunicazione del 50% circa due ore dopo la piastratura iniziale.

Dopo 24 ore dalla crescita iniziale, una serie di diluizioni di effettori di crescita è stata applicata sia a iCell GlutaNeuron che alla coltura corticale primaria di topo in uno scambio di media del 50%. Solo per iCell GlutaNeurons, è stato eseguito un ulteriore scambio di media del 50% 48 ore dopo (72 ore dopo la piastratura) con il mantenimento delle concentrazioni finali del farmaco.

Elaborazione immunoistochimica

Dopo cinque giorni in vitro (120 ore), le colture sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, le micropiastre da 96 pozzetti sono state lavate con PBS con Tween-20 allo 0,05% (PBST) utilizzando MultiFlo FX con il modulo AMX per cinque cicli (150 μL per ciclo, 30 μL/secondo). Le colture sono state permeabilizzate e bloccate per un'ora a temperatura ambiente con una soluzione PBS contenente 0,1% di TritonX-100 e 3% di BSA. Le colture permeabilizzate sono state incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari diluiti a 1:5.000 in una soluzione PBST con BSA al 3%. Dopo l'incubazione notturna nell'anticorpo primario, le piastre sono state lavate cinque volte con MultiFlo FX con modulo AMX. Gli anticorpi secondari sono stati applicati con una diluizione 1:500 in PBST contenente 1% BSA e 1 μM di colorante nucleare DAPI e incubati per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione secondaria dell'anticorpo, le piastre sono state lavate cinque volte con un modulo MultiFlo FX con AMX con PBST + 0,05% di sodio azide.

Cattura ed elaborazione delle immagini

Le immagini in fluorescenza multicanale sono state acquisite con ingrandimento 20x in modalità widefield in un montaggio di immagini 3 x 3 al centro di ciascun pozzetto attraverso la piastra da 96 pozzetti. La messa a fuoco è stata ottenuta utilizzando il metodo di messa a fuoco automatica laser. Le tessere di immagine sono state unite per generare un'unica immagine di grandi dimensioni per l'analisi della crescita dei neuriti. Le immagini cucite sono state sottratte dallo sfondo (palla rotolante da 100 μm) prima dell'analisi per una visualizzazione ottimale dei processi neuronali.

Analisi delle immagini

Le impostazioni predefinite del modulo di crescita dei neuriti Gen5 hanno fornito un punto di partenza per il rilevamento del soma e dei neuriti e sono state ulteriormente ottimizzate. Per ottenere i migliori risultati con le colture immunomarcate, si consiglia di utilizzare sia i segnali di immunocolorazione che quelli di colorazione nucleare per il rilevamento del soma. I valori ottimali per i parametri varieranno in base alle condizioni sperimentali e ci si aspetta che gli utenti valutino e regolino questi parametri secondo necessità.

Analisi ed adattamento dei dati

Per il tracciamento e l'adattamento di tutti i dati è stato utilizzato il software del lettore di micropiastre e dell'imager Gen5. Le relazioni dose-risposta erano adeguate con adattamenti a quattro parametri ed i punteggi Z sono stati calcolati in Gen5 utilizzando la differenza tra la media del trattamento e la media del controllo espressa in multipli della deviazione standard del controllo. Nella sintassi del software Gen5, la seguente formula è stata applicata in una fase di trasformazione per calcolare il punteggio Z per ciascun parametro di crescita: (X-MEAN(CTL1))/SD(CTL1)

Risultati e discussione

Panoramica del test di crescita dei neuriti

 I test di crescita dei neuriti sono utilizzati in tutti i sistemi modello neuroscientifici per valutare le caratteristiche della crescita dei neuroni e l'estensione dei processi sia negli stati compromessi che in quelli sani, nonché in risposta al trattamento farmacologico. In questo studio, due modelli cellulari frequentemente valutati attraverso test di crescita dei neuriti, coltura corticale di topo e neuroni derivati ​​da iPSC, sono stati esplorati in una dimostrazione di prova del modulo di crescita dei neuriti Gen5.

Uno schema generale di analisi della crescita dei neuriti per l'immunoistochimica è mostrato nella Figura 1. Le colture sono state piastrate su micropiastre ad alta densità e processate per la valutazione dopo cinque giorni di crescita. L'immunoistochimica multiplex è stata condotta utilizzando due marcatori per la crescita dei neuriti e una controcolorazione nucleare. Il dispensatore multimodale MultiFlo FX con AMX è stato utilizzato per lavaggi delicati delle piastre tra le fasi di immunoistochimica per massimizzare l'efficienza e ridurre al minimo i potenziali danni derivanti dal pipettaggio manuale. Le immagini fluorescenti multicanale sono state catturate automaticamente sul lettore multimodale di imaging cellulare Cytation 5 attraverso la piastra e analizzate con il modulo di crescita dei neuriti Gen5. Nel software Gen5 è possibile eseguire diversi tipi di analisi, inclusa l'analisi dose-risposta mostrata nella Figura 1, per valutare gli effetti del trattamento sulla crescita.

Raccolta ed elaborazione di immagini per l'analisi della crescita dei neuriti

Le misurazioni della crescita dei neuriti basate su immagini hanno utilizzato l'immunocitochimica fluorescente multicanale per valutare due marcatori di crescita dei neuriti e la controcolorazione nucleare. Per tutta l'acquisizione delle immagini è stato utilizzato un obiettivo 20x e le immagini sono state affiancate per campionare un'ampia regione per l'analisi. I montaggi sono stati uniti automaticamente per valutare un FOV centrale rappresentativo nel pozzetto. Le immagini sono state successivamente sottratte dallo sfondo per facilitare la visualizzazione dei processi neuronali. La sottrazione dello sfondo è un passaggio facoltativo non richiesto per l'analisi ma può aiutare a ottimizzare la visualizzazione dei neuriti per la visualizzazione dei risultati dell'analisi. La sottrazione dello sfondo ha prodotto miglioramenti relativamente minori con queste colture, come osservato confrontando i pannelli centrale e destro. I singoli canali fluorescenti sono mostrati  con una sovrapposizione composita. Nei neuroni in maturazione, la marcatura degli anticorpi MAP2 è localizzata principalmente sui dendriti, mentre l'anticorpo β-tubulina marca sia i compartimenti assonali che quelli dendritici. Questa compartimentazione può essere apprezzata nell'immagine sovrapposta in cui i neuriti MAP2-positivi sono anche β-tubulina positivi, ma molti più processi, potenzialmente i compartimenti assonali in via di sviluppo, sono etichettati solo dall'anticorpo β-tubulina.

Analisi della crescita dei neuriti basata su immagini fluorescenti multicanale

 Le immagini montate multicanale sono state elaborate per l'analisi della crescita dei neuriti sia per la colorazione con β-tubulina che per MAP2 passo dopo passo. Il modulo software Gen5 di crescita dei neuriti supporta l'analisi su un singolo canale fluorescente (ad esempio, colorazione dei neuroni) o può combinare un secondo canale fluorescente (ad esempio, colorazione DAPI) per ottimizzare il rilevamento. Per l'analisi dei neuriti con colture immunomarcate, si consiglia di utilizzare insieme sia la colorazione nucleare che l'immunomarcatura per ottenere risultati ottimali. La combinazione della colorazione nucleare con l'immunomarcatura aiuta a ottimizzare il rilevamento del soma sotto diversi aspetti. Innanzitutto, molti anticorpi neuronali, inclusi sia gli anticorpi β-tubulina che quelli MAP2, identificano fortemente la regione somatica perinucleare, ma sono deboli o assenti nel nucleo stesso. Le etichette nucleari riempiono efficacemente questi vuoti di immunoetichettatura per una migliore segmentazione del soma. In secondo luogo, il modulo di crescita dei neuriti Gen5 utilizza segnali nucleari per aiutare a separare i gruppi di somi neuronali e può quindi fornire conteggi di soma più accurati.

In terzo luogo, il modulo di crescita dei neuriti Gen5 include opzioni integrate progettate per sfruttare i segnali nucleari per limitare il rilevamento di nuclei non neuronali attraverso un criterio di sovrapposizione percentuale minima tra i segnali di colorazione nucleare e somatica. Infine, la colorazione nucleare fornisce un mezzo per impostare un limite di distanza per quanto lontano il segnale del soma può estendersi dal nucleo, chiamata distanza nucleo/soma nel modulo di crescita dei neuriti Gen5. Questa funzione aiuta a definire il confine tra il punto in cui finisce il soma e inizia il neurite e può essere regolata in base alle esigenze dell'utente. L'identificazione del soma è stata identificata con questa combinazione appositamente creata di caratteristiche del modulo di crescita dei neuriti Gen5 per identificare accuratamente i somi neuronali vitali per l'analisi.

Dopo l'ottimizzazione del rilevamento del soma, è stato successivamente ottimizzato il rilevamento dei neuriti. Le funzionalità di filtraggio dei neuriti del modulo di crescita dei neuriti Gen5 forniscono la possibilità di includere o ignorare i neuriti rilevati in base a diversi criteri. Innanzitutto, gli utenti possono scegliere di includere nell'immagine per l'analisi solo i neuriti collegati al soma. Scegliendo questa opzione di filtro verranno scartati i neuriti frammentati ed i neuriti che hanno origine dal soma che non si trovano all'interno dell'immagine. Gli scheletri dei neuriti sono stati filtrati per includere solo i neuriti collegati ai somi. Tuttavia, va notato che le immagini rappresentano solo una parte dell'intero campo analizzato e si prevede che alcuni neuriti visualizzati si colleghino al soma che non sono visibili all'interno della regione visualizzata.

 Ulteriori opzioni di filtro consentono agli utenti di impostare requisiti minimi per includere i neuriti per l'analisi, come lunghezze minime accettabili per neuriti frammentati, neuriti che si estendono direttamente da un soma e rami terminali di neuriti.

Risposta della crescita dei neuroni agli inibitori e ai potenziatori della crescita dei neuriti

 Come dimostrazione di principio, la crescita di neuroni crioconservati derivati ​​da iPSC e colture primarie di neuroni corticali di topo sono state valutate in risposta al trattamento con quattro farmaci precedentemente segnalati come potenziali potenziatori od inibitori della crescita dei neuriti. Le cellule sono state piastrate ad una densità di 10.000 cellule vive (determinata mediante conteggio delle cellule blu trypan post-scongelamento) per pozzetto in un formato di piastra da 96 pozzetti per la valutazione della crescita. Per iCell GlutaNeurons, allo scongelamento è stata osservata una percentuale di cellule vive pari a circa il 65% e le rese totali di cellule vive erano coerenti con le stime del produttore. Per le ECN di topo crioconservate, allo scongelamento è stata osservata una percentuale di cellule vive di circa il 50%, anch'essa in linea con le stime del produttore.

Dopo 24 ore dallo scongelamento (giorno di coltura 1), il 50% dei terreni di coltura dei neuroni è stato rimosso e sostituito con una serie di diluizioni di ciascuno dei quattro farmaci alle concentrazioni finali. Dopo 48 ore di esposizione al farmaco (giorno 3 della coltura), è stato eseguito un ulteriore scambio del 50% dei terreni per iCell GlutaNeurons (mantenendo le concentrazioni finali del farmaco), in linea con le raccomandazioni del produttore per il programma di aggiornamento dei terreni. Gli scambi di terreni tra i giorni di coltura 1 e 5 non sono stati eseguiti per la coltura ECN di topo, secondo le raccomandazioni del produttore dei terreni.

 Le colture di neuroni sono state fissate il giorno 5 della coltura e valutate per la crescita dei neuriti con immunocolorazione fluorescente e colorazione nucleare. Per queste colture, le impostazioni di rilevamento sono state ottimizzate per includere cellule che soddisfacevano i criteri di dimensione minima nucleare e somatica coerenti con le caratteristiche dei neuroni che erano vitali al momento della fissazione. Le impostazioni di rilevamento del modulo di crescita dei neuriti Gen5 utilizzate sono dettagliate. I parametri di rilevamento sono flessibili e destinati a fornire agli utenti la possibilità di ottimizzare l'analisi come desiderato su una gamma di caratteristiche cellulari previste.

Risposta della coltura neuronale derivata da iPSC alla stimolazione ed all'inibizione della crescita

La crescita delle colture neuronali in risposta al trattamento è stata inizialmente valutata per le colture derivate da iPSC. I risultati dell'analisi del modulo di crescita dei neuriti Gen5 vengono automaticamente riportati sia per le metriche a livello di immagine (ad esempio, la lunghezza totale della crescita nell'immagine), sia per i valori medi a livello di cellula (ad esempio, la lunghezza media dei neuriti per cellula). L'analisi è stata eseguita indipendentemente per ciascun anticorpo e le curve dose-risposta della crescita per la valutazione della β-tubulina e la valutazione della colorazione MAP2 sono presentate per diversi parametri della crescita.

Per i neuroni derivati ​​da iPSC, le risposte per ciascun farmaco erano coerenti con precedenti studi sulla capacità dei farmaci di potenziare (staurosporina e blebbistatina) o ridurre (6BIO e triptolide) la crescita dei neuriti. Tuttavia, la blebbistatina ha prodotto un effetto relativamente piccolo (circa il 20% ) aumento della crescita totale per iCell GlutaNeurons, rispetto alla staurosporina. La staurosporina ha promosso la crescita dei neuriti fino alle concentrazioni più elevate testate, dove è stata osservata improvvisamente una morte cellulare significativa, in linea con i rapporti precedenti. Per stimare l'effetto del farmaco attraverso l'adattamento, la concentrazione più alta del farmaco per la staurosporina è stata omessa dall'adattamento a quattro parametri.

A differenza dei due farmaci stimolanti testati, sia il 6BIO che il triptolide hanno dimostrato riduzioni sostanziali nella crescita dei neuriti con tipiche relazioni dose-risposta a quattro parametri. Oltre alle riduzioni della crescita totale misurate a livello di immagine, la lunghezza media dei neuriti per cellula, il conteggio dei rami e il numero dei neuriti sono stati tutti ridotti con l'applicazione sia di 6BIO che di triptolide. I risultati ottenuti con le valutazioni della colorazione con β-tubulina e MAP2 hanno indicato in gran parte un accordo generale sulle proprietà di crescita dei neuriti con alcune eccezioni. Per triptolide, entrambe le valutazioni della colorazione hanno fornito caratteristiche simili di inibizione della crescita e dose-risposta. Per 6BIO, tuttavia, la colorazione con β-tubulina ha indicato un grado maggiore di inibizione rispetto a MAP2. È possibile che questa differenza indichi che 6BIO ha un maggiore effetto inibitorio sulla presunta crescita assonale rispetto alla crescita dendritica.

Quando i valori del conteggio delle cellule sono coerenti, la crescita totale a livello di immagine riflette la crescita media di ogni singola cellula. Tuttavia, se il numero di cellule sta cambiando, ad esempio in caso di perdita di vitalità dei neuroni, è spesso informativo valutare anche la media di crescita per cellula. Oltre ai risultati a livello di immagine per la crescita totale, il modulo di crescita dei neuriti Gen5 calcola i valori medi di crescita dei neuriti per cellula utilizzando il conteggio del soma. Per questi trattamenti inibitori, sia la crescita media per cellula che quella media dell'immagine erano in generale accordo, indicando che l'effetto sulla crescita si è verificato a livello di cellula e non solo a livello di immagine. Ciò è coerente con l’effetto inibitorio specifico del 6BIO e del triptolide sulla crescita dei neuriti e non semplicemente con il riflesso di una perdita generale di vitalità cellulare.

Valutazione della risposta della crescita della crescita della coltura corticale di topo crioconservata

È stata condotta un'indagine parallela sulla crescita per colture corticali primarie di topo crioconservate ed è stata valutata nello stesso arco temporale, serie di concentrazioni di farmaci e approccio immunoistochimico. Mostra immagini di esempio della crescita dei neuriti valutate nei pozzetti di controllo e nei pozzetti trattati con effettori positivi e negativi come indicato dopo cinque giorni di coltura. Per semplificare il confronto con le colture derivate da iPSC, i risultati della crescita dei neuriti sono presentati solo per la colorazione con β-tubulina.

La blebbistatina ha prodotto un grande aumento nella crescita dei neuriti nelle colture corticali di topo, dimostrato da valutazioni dose-risposta su più parametri utilizzando sia l'analisi del modulo di crescita dei neuriti Gen5 che l'analisi cellulare. È interessante notare che la blebbistatina è stato l'unico farmaco che ha dimostrato un aumento dose-dipendente del numero di somi. Poiché la blebbistatina inibisce la miosina II implicata sia nell'apoptosi che nella crescita neuronale, è possibile che la blebbistatina sia protettiva contro parte della perdita di cellule apoptotiche correlata alla crioconservazione della coltura cellulare primaria.

La staurosporina, tuttavia, ha dimostrato un effetto complesso nei neuroni primari del topo che differiva dal miglioramento della crescita relativamente robusto e coerente osservato per i neuroni derivati ​​da iPSC. La vitalità cellulare era ridotta, poiché la conta del soma, la crescita totale e i rami totali diminuivano con l'aumentare delle concentrazioni. Tuttavia, le cellule che sono sopravvissute a concentrazioni di staurosporina più elevate hanno mostrato un numero medio maggiore di escrescenze e rami, in concomitanza con una lunghezza media misurata più breve. Questa combinazione di effetti suggerisce che la staurosporina può promuovere la protrusione dei neuriti in questo modello, ma non la lunghezza complessiva. Sebbene la crescita dei neuroni derivati ​​dalle iPSC sia stata notevolmente inibita dal triptolide, la crescita dei neuroni coltivati ​​con ECN di topo è stata molto meno sensibile al triptolide, come si riflette nella dimensione dell’effetto ridotta e nella curva dose-risposta comparativamente spostata attraverso molteplici misure di crescita. Sebbene il triptolide abbia comportato una diminuzione relativamente piccola della lunghezza totale dei neuriti alle concentrazioni più elevate testate, la lunghezza media e il numero di ramificazioni delle cellule sopravvissute sono rimasti invariati; l'assenza di effetti medi per cellula suggerisce una diminuzione generale della vitalità dei neuroni che era coerente con la diminuzione osservata nella conta del soma.

Riepilogo comparativo della crescita dei neuroni primari e derivati ​​da iPSC

Fornisce un riepilogo delle misurazioni del modulo di crescita dei neuriti del software Gen5 per i modelli di coltura di neuroni di topo e derivati ​​da iPSC. Per ciascun tipo di coltura sono indicate le medie dei pozzetti di controllo, nonché la dimensione percentuale dell'effetto (rispetto ai valori dei pozzetti di controllo) ed i valori IC/EC50 nei parametri di crescita. Per la maggior parte dei trattamenti, le risposte metriche di crescita erano adeguatamente adattate alle relazioni dose-risposta a quattro parametri ed ai valori IC/EC50 calcolati automaticamente nel software Gen5 per l’imaging e la microscopia. In alcuni casi, tuttavia, i plateau per gli effetti dipendenti dalla concentrazione non erano ben risolti. In questi casi, la dimensione dell’effetto riportata e i valori IC/EC50 sono stati invece riportati al 50% della risposta massima della concentrazione di test più alta utilizzando valori di interpolazione adatti nel software Gen5.

Per ciascuna metrica, i punteggi Z sono stati calcolati nel software Gen5 per determinare se le medie del trattamento erano significativamente diverse dalla media di controllo per ciascun parametro di crescita. Si è ritenuto che i parametri di crescita con valori assoluti del punteggio Z superiori a due in più concentrazioni consecutive avessero una media dei parametri significativamente diversa dal controllo. La dimensione dell'effetto e i valori IC/EC50 sono inclusi per i trattamenti con risposte significative. I parametri di crescita che non hanno comportato differenze significative rispetto al controllo sono indicati con "ns."

 Oltre ai parametri predefiniti misurati dal modulo di crescita dei neuriti Gen5, è incluso un parametro aggiuntivo che calcola la percentuale di neuroni che hanno avuto una crescita. Per questa valutazione percentuale, solo le cellule che mostravano conteggi multipli di neuriti (> 1) sono state considerate aventi una crescita significativa e incluse nella percentuale. Questo parametro è stato generato utilizzando la funzionalità "Group Neurons" del modulo neuriti per contare le cellule e creare sottopopolazioni basate su diverse misurazioni disponibili. I criteri di raggruppamento dei neuroni sono flessibili per consentire raggruppamenti specificati dall'utente in base a più parametri come la dimensione del soma, l'intensità del segnale od il conteggio dei neuriti.

Conclusione

Le soluzioni automatizzate per la crescita dei neuriti basate su immagini sono essenziali per consentire indagini neurobiologiche rapide e ad alto rendimento su larga scala. Il modulo di crescita dei neuriti Agilent BioTek Gen5 qui descritto fornisce una soluzione flessibile e potente che sfrutta i vantaggi di un sistema automatizzato ad alta produttività per l'analisi di immagini multimodali. Una caratteristica chiave del modulo di crescita dei neuriti Gen5 per i test di crescita dei neuriti è la flessibilità dell'analisi multicanale su più canali e modalità di fluorescenza per supportare un'ampia gamma di approcci di crescita dei neuriti.

Questo studio ha fornito una dimostrazione di principio per l'analisi della crescita dei neuriti di modelli di coltura di neuroni murini primari e derivati ​​da iPSC rilevanti per un'ampia gamma di aree di ricerca neurobiologica. Ci siamo concentrati sulla valutazione di questi modelli chiave di crescita dei neuriti in un approccio basato sull'immunoistochimica comunemente usato per dimostrare l'usabilità e le prestazioni della piattaforma. Il software per lettore di micropiastre e imager Agilent BioTek Gen5 ha integrato l'acquisizione automatizzata delle immagini, l'elaborazione ed il rilevamento della crescita dei neuriti all'interno di un'unica interfaccia ed in un processo graduale ottimizzato. Le funzionalità di tracciamento ed adattamento dei dati del lettore di micropiastre Gen5 e del software imager hanno trasformato prontamente i risultati del rilevamento dell'immagine dei neuriti in un'analisi quantitativa degli effetti del trattamento. In entrambi i modelli di coltura testati, sono stati misurati effetti dose-risposta significativi su più parametri di crescita dei neuriti per diversi modulatori della crescita neuronale.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Agilent/2024/an-fluorescence-image-based-neurite-outgrowth-5994-7380EN-agilent%20(3).pdf