Nuovi schermi ultrasensibili per il morbo di Parkinson / New ultrasensitive screens for Parkinson’s disease

Nuovi schermi ultrasensibili per il morbo di Parkinson. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questo tipo di applicazione. / New ultrasensitive screens for Parkinson’s disease. The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this type of application.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

David Walt è professore alla Harvard Medical School, con incarichi presso il Dipartimento di Patologia del Brigham and Women's Hospital (entrambi MA, USA). Il suo laboratorio copre una vasta gamma di argomenti, tra cui la diagnostica e lo studio della malattia di Parkinson ed il suo recente lavoro ha portato ad un nuovo ed entusiasmante test diagnostico per la malattia.

Qui rivela un nuovo approccio al test dell'alfa-sinucleina che potrebbe accelerare la diagnosi della malattia di Parkinson, documentata in un recente articolo, e consentire ai ricercatori di individuare la condizione in una fase precedente quando si può fare di più per ritardarne la progressione. Rivela inoltre il suo lavoro in corso con le vescicole extracellulari ed il loro potenziale diagnostico per le malattie neurodegenerative.

Quali sono le attuali procedure standard per la diagnosi della malattia di Parkinson?

Le attuali procedure abbracciano due ambiti diversi. Il primo, quello maggiormente utilizzato, si basa sui sintomi clinici; i medici osserveranno le caratteristiche chiave dei loro pazienti e poi li sottoporranno ad una serie di test cognitivi e funzionali per un periodo di tempo. Ciò consente loro di valutare se le prestazioni dei loro pazienti stanno peggiorando rispetto alle loro risposte a questi test standard.

L'altro metodo viene utilizzato se si sospetta che qualcuno abbia la malattia di Parkinson e necessita di conferma. In questo caso, ci sono test di imaging che comportano l’iniezione di un tracciante radioattivo seguito da una scansione SPECT del cervello, che interroga i recettori della dopamina nel cervello.

Dove queste attuali pratiche diagnostiche falliscono nella gestione della malattia di Parkinson?

Entrambi questi test monitorano essenzialmente i sintomi o le manifestazioni in fase successiva della malattia, non arrivano alla risoluzione a livello molecolare. Pertanto, non arrivano alla biochimica fondamentale alla base della malattia. Di conseguenza, non è possibile contrarre la malattia molto presto nella sua progressione od utilizzare questi test per indagare sulla fisiopatologia della condizione.

Gli esami attuali vengono effettuati solo quando cominciano a comparire i sintomi ed a quel punto la malattia è già progredita in modo significativo. Il cervello di pazienti deceduti in fasi diverse dimostra che anche all'inizio dei sintomi c'è già un significativo deterioramento del tessuto cerebrale a causa della formazione di placche.

Come sta lavorando il vostro laboratorio per affrontare queste carenze e migliorare le nostre capacità diagnostiche per il Parkinson?

Il mio laboratorio si è storicamente concentrato sullo sviluppo di nuove tecnologie in grado di rispondere alle esigenze diagnostiche cliniche non soddisfatte. Lo facciamo sviluppando metodi ultrasensibili per il rilevamento. La più nota di queste è la tecnologia di array di singole molecole o "Simoa", in grado di digitalizzare i test immunologici utilizzati da molti anni. Questa digitalizzazione ci consente di rilevare proteine ​​con una concentrazione fino a 10.000 volte inferiore rispetto ai tradizionali test immunologici utilizzati nei laboratori clinici negli ultimi quattro decenni.

Abbiamo una nuova tecnologia che abbiamo segnalato l’anno scorso chiamata Mosaic, che è una tecnologia ancora più potente in grado di rilevare concentrazioni molto basse di molecole sia nel liquido cerebrospinale (CSF) che nel plasma sanguigno. Ecco dove si trova la nostra attenzione ora; nel tentativo di rilevare questi marcatori a bassissima concentrazione che sono specifici delle malattie neurodegenerative. Rilevando questi biomarcatori di basso livello, speriamo di raccogliere indicazioni molto precoci che qualcuno svilupperà il Parkinson in modo che possa essere inserito precocemente in un piano di gestione interventistica.

Quali molecole stai cercando di rilevare per la malattia di Parkinson?

Uno di questi è l’alfa sinucleina, la proteina che genera fibrille nel cervello che formano depositi o placche che sono sicuramente il segno della malattia. Ciò che stiamo cercando di fare è rilevare le fibrille di alfa-sinucleina circolanti nel flusso sanguigno, il che indica che esiste un processo anomalo che genera queste fibrille nei pazienti che alla fine svilupperanno il morbo di Parkinson.

Ma ci sono anche altri indicatori su cui ci stiamo concentrando. Stiamo esaminando proteine ​​modificate post-traduzionalmente che indicano che è in corso un metabolismo avverso. Lo stiamo facendo isolando le vescicole extracellulari, abbreviate in EV, che sono minuscoli pacchetti contenenti contenuti cellulari avvolti in una sezione della membrana cellulare che si è staccata da una cellula. Speriamo di poter isolare queste vescicole extracellulari dal cervello, tirarli giù, isolarne il contenuto e misurare le fibrille di alfa-sinucleina ed altre proteine ​​che potrebbero indicare che c'è un metabolismo alterato nel cervello di questi individui.

Quali sono i pro ed i contro del sangue e del liquido cerebrospinale (CSF) come fonti per il rilevamento dell’alfa sinucleina e delle vescicole extracellulari?

La differenza tra liquido cerebrospinale e plasma sanguigno è importante. È generalmente accettato che se si cercano biomarcatori rilasciati dal cervello, il liquido cerebrospinale è il fluido ideale perché è in contatto diretto con il cervello ma non con altri tessuti ed organi del corpo. Il problema con l’uso del sangue è che sia gli EV che l’alfa sinucleina sono presenti in molti tessuti. Quindi ciascuno di questi biomarcatori, se rilevati nel sangue, hanno il potenziale per provenire da qualche altro tessuto oltre al cervello.

Inoltre, la barriera emato-encefalica impedisce agli oggetti di entrare nel flusso sanguigno, quindi la quantità di materiale proveniente dal cervello che entra nel sangue ha una concentrazione molto bassa. Questo è il motivo per cui sono necessari metodi ultrasensibili per rilevarli. Uno dei motivi per cui usiamo le vesciocle extracellulari è che possiamo estrarre dal sangue le vescicole extracellulari che hanno proteine ​​specifiche sulla loro superficie che sono presenti solo nel cervello. In questo modo, speriamo di poter far esplodere queste vescicole extracellulari ed analizzarne il contenuto per vedere cosa c'è esclusivamente nelle cellule del cervello.

Per il test dell’alfa-sinucleina, il nostro obiettivo iniziale era dimostrare la sua utilità nel liquido cerebrospinale, dove potevamo essere più certi che provenisse dal cervello. Man mano che sviluppiamo queste specifiche capacità di pull-down, aumentiamo la loro sensibilità e siamo in grado di rilevare ed estrarre le vescicole extracellulari dal cervello nel sangue e cercare le proteine ​​specifiche del Parkinson al loro interno, passeremo quindi all'analisi del plasma sanguigno. Il plasma sanguigno è ovviamente molto più suscettibile ad un uso diffuso. Le persone sospettate di avere il Parkinson potrebbero essere disposte a sottoporsi ad una puntura lombare per estrarre il liquido cerebrospinale, ma come strumento di screening è una procedura invasiva e scomoda, quindi non sarà qualcosa che può essere fatto per milioni di persone.

Un punto importante da notare è che, sebbene l’alfa sinucleina possa essere trovata in queste vescicole ectracellulari, non è necessariamente necessario utilizzare l’approccio EV per garantire che il loro rilevamento sia specifico per il Parkinson. Questo perché se riusciamo a rilevare che le alfa-sinucleine sono aggregate in fibrille nel sangue, da qualunque parte provengano, è un brutto segno che indica le fasi iniziali del Parkinson. Quindi, se riusciamo a rilevare questi aggregati di alfa-sinucleina utilizzando il nostro metodo ultrasensibile, allora sappiamo che quell'individuo ha la possibilità di una diagnosi di malattia di Parkinson.

Come avete raggiunto questo livello di sensibilità con questo test?

In realtà è abbastanza semplice. Suddividiamo un campione del liquido cerebrospinale o del sangue del paziente in molti reattori diversi, ad esempio una serie di micropozzetti con molti "micropozzetti" che contengono ciascuno un piccolo volume del campione. I pozzetti contengono un volume così piccolo che in ciascun microreattore può esserci al massimo una sola molecola del biomarcatore che stiamo cercando di rilevare. La maggior parte dei microreattori non contiene una molecola biomarcatore ma occasionalmente sarà presente una singola molecola. Quindi sigilliamo i microreattori in modo che la molecola non possa fuoriuscire.

Per il test dell'alfa-sinucleina, inseriamo monomeri di alfa-sinucleina in quei pozzetti insieme ad un colorante che si legherà ad una fibrilla di alfa-sinucleina. Nel corso del tempo, se c'è una singola fibrilla intrappolata in uno di questi microreattori, reagirà con altri monomeri di alfa-sinucleina e creerà fibrille più grandi, alle quali questo colorante si legherà. Una volta legato, il colorante diventerà fluorescente, creando una lettura.

Possiamo quindi contare il numero di microreattori che hanno un segnale fluorescente, dandoci una misura quantitativa del numero di fibrille di alfa-sinucleina nel campione. Il vantaggio è che se stai cercando di vedere se un paziente sta progredendo, puoi prelevare campioni a distanza di sei mesi e vedi che c'è un aumento nel numero di fibrille di alfa-sinucleina presenti, quindi sai che il paziente sta progredendo ed a quale tasso.

Nel nostro recente articolo abbiamo anche dimostrato che possiamo utilizzare il test per identificare gli inibitori che impediscono l’aggregazione dell’alfa-sinucleina. Se questi inibitori verranno finalmente approvati per l’uso farmacologico, allora potrebbero essere usati per trattare i soggetti in fasi molto precedenti, quando le fibrille di alfa-sinucleina vengono rilevate per la prima volta nel sangue. La speranza è che questi farmaci siano efficaci nei soggetti in una fase molto più precoce della malattia rispetto ai pazienti sintomatici attualmente arruolati negli studi.

Come si può applicare questo test all’approccio EV di cui hai parlato prima?

Per rispondere a questa domanda devo tornare un po’ indietro. Un paio di anni fa, abbiamo pubblicato un articolo che descriveva in dettaglio l'uso di un marcatore chiamato L1CAM che tutti nella comunità utilizzavano per abbattere le vescicole extracellulari neuronali. Abbiamo dimostrato che questo marcatore non era in realtà specifico del cervello e nemmeno una proteina transmembrana; è stato semplicemente qualcosa che è rimasto attaccato all'esterno di queste membrane. Ci siamo sentiti in obbligo nei confronti della comunità di andare alla ricerca di qualcosa che funzionasse effettivamente per abbattere le vescicole extracellulari derivati ​​dal cervello.

Attualmente siamo nelle fasi finali della convalida di una serie di marcatori che abbiamo scoperto che ci consentiranno di adempiere a tale obbligo, di cui parleremo presto. Siamo stati in grado di utilizzare questi marcatori in questo test per estrarre EV neurospecifici, che possiamo aprire e caricare nei micropozzetti e quindi seguire la stessa procedura che ho descritto in risposta ad una delle tue domande precedenti.

Se ci fosse un'informazione od una tecnologia fantastica a cui potresti accedere per comprendere meglio la malattia di Parkinson e la sua diagnosi, quale sarebbe?

È un'ottima domanda. Il mio desiderio più grande sarebbe quello di avere un pannello multiplex di marcatori circolanti nel flusso sanguigno che ci permetta di identificare specificamente un paziente nelle prime fasi del processo patologico. Attualmente la maggior parte dei biomarcatori individuati sono presenti anche in quasi tutti i tessuti. Mi piacerebbe trovare qualcosa che sia unico e specifico per un cervello alterato da poter misurare in una fase molto precoce ed identificando quel marcatore saremmo anche in grado di chiarire il meccanismo alla base della malattia.

Per me non è chiaro se l'alfa-sinucleina stessa sia una causa od un correlato della malattia. Mi piacerebbe avere qualcosa che sia un biomarcatore causale confermato, che ci aiuti non solo a rilevare e diagnosticare la malattia, ma ci aiuti anche a comprenderla nelle fasi iniziali, in modo da poter intervenire terapeuticamente.

ENGLISH

David Walt is a professor at Harvard Medical School, with appointments in the Department of Pathology at Brigham and Women’s Hospital (both MA, USA). His lab covers a wide range of topics, including diagnostics and the study of Parkinson’s disease and his recent work has led to an exciting potential new diagnostic test for the condition.

Here he reveals a new alpha-synuclein assay approach that could fast track the diagnosis of Parkinson’s disease, documented in a recent paper, and allow researchers to catch the condition at an earlier stage when more can be done to delay its progression. He also reveals his ongoing work with extracellular vesicles and their diagnostic potential for neurodegenerative diseases.

What are the current standard procedures for Parkinson’s disease diagnostics?

The current procedures encompass two different realms. The first, which is primarily used, relies on clinical symptoms; clinicians will observe key characteristics in their patients and then put them through a series of cognitive and functional tests over a period of time. This allows them to assess whether their patients’ performances are deteriorating with respect to their responses to these standard tests.

The other method is used if somebody is suspected of having Parkinson’s disease, and needs confirmation. In this case, there are imaging tests involving the injection of a radioactive tracer followed by a SPECT scan of the brain, which interrogates dopamine receptors in the brain.

Where do these current diagnostic practices fall short in the management of Parkinson’s disease?

Both of these tests essentially monitor the symptoms or later-stage manifestations of the disease, they don’t get down to molecular-level resolution. Therefore, they don’t get to the fundamental underlying biochemistry of the disease. As a result, you can’t catch the disease very early in its progression or use these tests to help investigate the pathophysiology of the condition.

The current tests are only carried out once symptoms begin to appear and at that point, the disease has already progressed significantly. The brains of patients who have passed away at different stages demonstrate that even at early symptom onset, there is already significant deterioration of brain tissue due to the formation of plaques.

How is your lab working to address these shortcomings and improve our diagnostic capabilities for Parkinson’s?

My lab has historically focused on developing new technologies that can address unmet clinical diagnostic needs. We do that by developing ultrasensitive methods for detection. The most well known of these is a single molecule array technology or ‘Simoa’, which is able to digitize the immunoassays that have been used for many years. This digitization enables us to detect proteins that are up to 10,000 times lower in concentration than traditional immunoassays used in clinical laboratories for the last four decades.

We have a new technology that we reported last year called Mosaic, which is an even more powerful technology able to detect very low concentrations of molecules in both cerebrospinal fluid (CSF) as well as in blood plasma. That’s where our focus lies now; in trying to detect these very low-concentration markers that are specific to neurodegenerative diseases. By detecting these low-level biomarkers, we hope to pick up very early indications that somebody’s going to develop Parkinson’s so they can be put on an interventional management plan early.

What molecules are you looking to detect for Parkinson’s disease?

One of them is alpha synuclein, the protein that generates fibrils in the brain that form deposits or plaques that are certainly a signature of the disease. What we are trying to do is detect alpha-synuclein fibrils circulating in the bloodstream, which indicates that there is some abnormal process generating these fibrils in patients who ultimately will develop Parkinson’s.

But there are other markers that we’re also focusing on. We’re looking at post-translationally modified proteins that indicate there is adverse metabolism taking place. We’re doing that by isolating extracellular vesicles, abbreviated as EVs, which are tiny packets containing cell contents wrapped in a section of the cell membrane that has split off from a cell. We hope we can isolate these EVs from the brain, pull them down, isolate their contents, and measure alpha-synuclein fibrils and other proteins that might indicate that there’s altered metabolism in the brains of these individuals.

What are the pros and cons of blood and cerebrospinal fluid (CSF) as sources for the detection of alpha synuclein and extracellular vesicles?

The difference between CSF and blood plasma is an important one. It is generally accepted that if you’re going to try to find biomarkers that are released from the brain, CSF is the ideal fluid because it’s in direct contact with the brain but no other tissues and organs in the body. The problem with using blood is that both EVs and alpha synuclein are present in lots of tissues. So either of these biomarkers, if detected in the blood, have the potential to originate from some other tissue besides the brain.

What’s more, the blood–brain barrier prevents things from crossing into the bloodstream, so the amount of material from the brain that gets into the blood is very low in concentration. This is why you need ultrasensitive methods to detect them. One of the reasons that we’re using EVs is that we can pull down EVs from the blood that have specific proteins on their surface that are only present in the brain. By doing that, we hope that we can burst those EVs and analyze their contents to see what is in the cells of the brain exclusively.

For the alpha-synuclein assay, our initial focus was on demonstrating its utility in CSF, where we could be more certain that it had come from the brain. As we develop these specific pull-down capabilities, increase their sensitivity and are able to detect and extract EVs from the brain in the blood and search for Parkinson’s specific proteins within them, we will then move to analyzing blood plasma. Blood plasma is obviously much more amenable to widespread use. People who are suspected of having Parkinson’s may be willing to give a spinal tap to extract CSF, but as a screening tool, it’s an invasive and uncomfortable procedure, so won’t be something that can be done for millions of people.

An important point to note is that, while alpha synuclein may be found in these EVs, we don’t necessarily need to use the EV approach to ensure their detection is specific to Parkinson’s. This is because if we can detect alpha synucleins are aggregated into fibrils in the blood, wherever they are coming from, it’s a bad sign that indicates the early stages of Parkinson’s. So if we can detect these alpha-synuclein aggregates using our ultrasensitive method, then we know that individual has the possibility of a Parkinson’s disease diagnosis.

How have you achieved this level of sensitivity with this assay?

It’s actually quite simple. We partition a sample of the patient’s CSF or blood into many different reactors, such as a microwell array with many ‘microwells’ that each contain a small volume of the sample.  The wells contain such a small volume that there can only be at most one molecule of the biomarker we are looking to detect in each microreactor. Most of the microreactors do not contain a biomarker molecule but occasionally there will be a single molecule present. We then seal the microreactors so the molecule can’t escape.

For the alpha-synuclein assay, we put monomers of alpha synuclein in those wells along with a dye that will bind to an alpha-synuclein fibril. Over time, if there is a single fibril trapped in one of these microreactors, it will react with other monomers of alpha synuclein and create larger fibrils, to which this dye will bind. Once bound the dye will fluoresce, creating a readout.

We can then count the number of microreactors that have a fluorescent signal, giving us a quantitative measure of the number of alpha-synuclein fibrils in the sample. The advantage is that if you’re trying to see if a patient is progressing, you can take samples six months apart, and you see there’s an increase in the number of alpha-synuclein fibrils present, then you know that patient is progressing and at what rate.

We also showed in our recent paper that we can use the test to identify inhibitors that prevent alpha-synuclein aggregation. If these inhibitors are eventually approved for drug use, then they could be used to treat individuals at much earlier stages when the alpha-synuclein fibrils are first detected in their blood. The hope is that these drugs would be efficacious in individuals at a much earlier stage of the disease than symptomatic patients who are currently enrolled in studies.

How can this assay be applied to the EV approach you mentioned earlier?

To answer this question I need to go back a little. A couple of years ago, we published a paper detailing the use of a marker called L1CAM that everyone in the community was using to pull down neuronal EVs. We showed that this marker was not actually specific to the brain or, in fact, even a transmembrane protein; it was just something that happened to get stuck to the outside of these membranes. We felt an obligation to the community to go on a search to find something that actually worked to pull down brain-derived EVs.

We’re currently in the final stages of validating a number of markers that we’ve discovered that will allow us to fulfill that obligation, which we will report soon. We have been able to use these markers in this assay to pull down neurospecific EVs, which we can break open and load into the microwells and then follow the same procedure as I described in answer to one of your prior questions.

If there was one piece of information or a fantasy technology that you could access, to better understand Parkinson’s disease and its diagnosis what would it be?

It’s a great question. My biggest wish would be to have a multiplexed panel of markers circulating in the bloodstream that would enable us to specifically identify a patient early in the disease process. Currently, most of the biomarkers identified are also present in almost all tissues. I’d love to find something that is unique and specific to an altered brain that we could measure at a very early stage and by identifying that marker, we would also be able to elucidate the underlying mechanism of the disease.

To me, it’s unclear whether alpha synuclein itself is a cause or a correlate of disease. I would love to have something that is a confirmed causative biomarker, that helps us not only detect and diagnose disease but also helps us understand the disease at the early stages, such that we could intervene therapeutically.

Da:

https://www.biotechniques.com/diagnostics-preclinical/new-ultrasensitive-screens-for-parkinsons-disease/?utm_campaign=BioTechniques%20-%20Daily%20NL&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz-_9sExb0YWhBlTMu45IVTGALIWN1tnyhKYF2zJHg48oPfmC10HbLaCGlx1BlxbaRRG2dH5z5VRQghEMrZmBrAAfMb6xjIeWo6ozdRQTcfHXY7cnL98&_hsmi=312934677&utm_content=312897200&utm_source=hs_email