Fluoro-zuccheri addolciscono il rilevamento ed il trattamento dei patogeni microbici / Fluoro-Sugars Sweeten Detection and Treatment of Microbial Pathogens

 Fluoro-zuccheri addolciscono il rilevamento ed il trattamento dei patogeni microbici / Fluoro-Sugars Sweeten Detection and Treatment of Microbial Pathogens

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Gli scienziati hanno trovato un modo per creare zuccheri artificiali che potrebbero portare a metodi più accurati per diagnosticare e forse curare le malattie. La collaborazione di scienziati accademici ed industriali in Europa, tra cui gruppi dell'Università di Manchester e dell'Università di Leeds, ha sviluppato un metodo per creare "zuccheri fluorurati" o "glicofluoroformi", zuccheri glicanici specifici contenenti molecole di fluoro, che potrebbero bloccare i patogeni. Il gruppo ha anche dimostrato la potenziale utilità diagnostica del loro approccio per rilevare una tossina batterica utilizzando la tecnologia del flusso laterale.

Lo studio fornisce la prova che i fluorozuccheri artificiali possono essere utilizzati per perfezionare il riconoscimento di patogeni o biomarcatori o persino per scoprire nuovi farmaci. Offrono anche un'alternativa agli anticorpi nella diagnostica a basso costo, che non richiedono test sugli animali per essere scoperti e sono stabili al calore. "A Manchester, siamo molto interessati e stiamo attualmente esplorando come possiamo distribuire glicani naturali e non naturali nella diagnostica", ha affermato Matthew Gibson, PhD, professore presso l'University of Manchester Institute of Biotechnology, parlando con GEN . "La nostra piattaforma ha diversi vantaggi, come il fatto di non dover utilizzare tecnologie animali per generare nuovi anticorpi, e le nanoparticelle glicosilate sono molto stabili al calore ed ad altri fattori di stress, quindi potrebbero trovare impiego in ambienti con risorse inferiori e per la preparazione alle pandemie".

Nel loro articolo pubblicato su Nature Communications (" Sintesi e screening di una libreria di deossifluoro-analoghi di

 Lewis X rivelano un riconoscimento differenziale da parte dei partner che legano i glicani "), Gibson e colleghi hanno scritto: "Prevediamo che i nostri dati preliminari che dimostrano l'applicazione dell'approccio del glicofluoroformio per il rilevamento del flusso laterale di una tossina batterica accelereranno lo sviluppo di diagnosi e terapie basate sui glicani".

Gli zuccheri svolgono un ruolo cruciale nella salute e nelle malattie umane, ben oltre l'essere una semplice fonte di energia. Gli zuccheri complessi chiamati glicani rivestono tutte le nostre cellule e sono essenziali per una sana funzionalità. Questi zuccheri vengono spesso dirottati da patogeni come l'influenza, la SARS-CoV-2 ed il colera, per infettarci. "Le interazioni mediate dai glicani svolgono un ruolo cruciale in biologia e medicina, influenzando la segnalazione, le risposte immunitarie e la patogenesi delle malattie", hanno scritto gli autori, "... e sono stati fatti progressi significativi nella comprensione di questi processi attraverso studi sul riconoscimento delle sequenze di glicani da parte delle proteine ​​che legano i glicani".

Tuttavia, lo stesso glicano può legarsi a molte proteine ​​diverse, e questo rende difficile usare i glicani come bersagli per diagnosi precise o approcci terapeutici. "... l'uso dei glicani nella biosensoristica e nella diagnosi è limitato dalla cross-reattività, poiché alcuni motivi glicanici possono essere riconosciuti da più recettori proteici biologicamente distinti", ha continuato il gruppo. "Questo solleva la sfida di come si possano sviluppare piccole sonde molecolari per diagnosi o terapie che possano distinguere tra le interazioni di diverse proteine ​​con lo stesso glicano".

"Lewis X è un motivo glicano che è un ligando per il riconoscimento in numerosi contesti con molte proteine ​​diverse", hanno spiegato ulteriormente gli autori. Il trisaccaride è espresso, ad esempio, sulle cellule tumorali e sugli zuccheri del latte (gli autori hanno citato studi che indicano che può proteggere dalle tossine e dai patogeni coinvolti in alcune malattie infantili) e sulla superficie di alcuni patogeni, tra cui l' Helicobacter pylori che causa il cancro gastrico e il parassita schistosoma mansoni, che causa la schistosomiasi. "Data l'importanza

 biologica di Lewis X , sarebbe auspicabile, per scopi diagnostici e terapeutici, avere sonde chimiche in grado di distinguere tra ciascuna delle diverse proteine ​​con cui questo glicano può interagire", hanno inoltre osservato gli investigatori.

Per il loro studio riportato, Gibson e colleghi hanno utilizzato una combinazione di enzimi e sintesi chimica per creare una libreria di 150

 glicofluoroformi di Lewis X , a cui avevano aggiunto atomi di fluoro in siti specifici. Il fluoro è molto piccolo, il che significa che i fluoro-zuccheri risultanti hanno mantenuto la loro stessa forma 3D, ma i fluoruri hanno interferito con il modo in cui le proteine ​​si legano a loro. Il gruppo ha quindi caratterizzato e studiato 24 glicani dalla libreria, che hanno incorporato in nanoparticelle o microarray, per vedere se i diversi modelli di fluorurazione erano associati al legame da parte di

 specifiche proteine ​​leganti Lewis X , inclusi anticorpi e tossine batteriche.

Kristian Hollie, PhD, che ha guidato la produzione della libreria di fluoro-zuccheri presso l'Università di Leeds, ha affermato: "Abbiamo utilizzato enzimi per assemblare rapidamente i blocchi di costruzione di fluoro-zuccheri per creare 150 diverse versioni di un glicano biologicamente importante. Siamo rimasti sorpresi nello scoprire quanto bene gli enzimi naturali funzionino con questi zuccheri modificati chimicamente, il che lo rende una strategia davvero efficace per scoprire molecole che possono legarsi selettivamente".

La coautrice Sabine Flitsch, PhD, ricercatrice del Manchester Institute of Biotechnology presso l'Università di Manchester, ha aggiunto: "Una delle tecnologie chiave utilizzate in questo lavoro è la biocatalisi, che utilizza enzimi per produrre gli zuccheri molto complessi e diversificati necessari per la libreria. La biocatalisi accelera notevolmente lo sforzo di sintesi richiesto ed è un metodo molto più ecologico e sostenibile per produrre le sonde fluorurate necessarie".

I risultati degli studi dei ricercatori hanno mostrato che alcuni dei glicofluoroformi preparati potrebbero essere utilizzati per rilevare la tossina del batterio del colera, indicando che potrebbero essere utilizzati in test semplici ed a basso costo, simili ai test del flusso laterale ampiamente utilizzati per la gravidanza od ai test SARS-CoV-2. Gli autori hanno riferito, "... l'incorporazione di un sottoinsieme di questi glicani in nanoparticelle o un microarray ha rivelato uno spettro sorprendente di intensità di legame distinte tra diverse proteine ​​che

 riconoscono Lewis X ... Nel complesso, i nostri studi di legame di microarray e nanoparticelle rivelano che diverse proteine ​​con un sito di legame

 Lewis X hanno modalità di riconoscimento distintive per questo importante trisaccaride".

Gibson ha osservato a GEN , "... il mio gruppo ha precedentemente depositato brevetti su analisi glico a flusso laterale, mostrando come i glicani possono essere introdotti in particelle d'oro per abilitarli come alternative agli anticorpi nel flusso laterale. Prevedo che ci sia molto spazio per l'innovazione nella diagnostica non basata sugli anticorpi... In termini di applicazioni cliniche, all'inizio della pandemia di COVID-19, il mio gruppo ha guidato una collaborazione per realizzare una diagnostica rapida SARS-COV-2 basata sui glicani: l'abbiamo convalidata in campioni clinici che hanno mostrato buone prestazioni. Il nuovo lavoro che abbiamo pubblicato oggi è importante per consentirci di ottenere maggiore selettività e specificità ed abbiamo condotto alcuni studi modello per il rilevamento della tossina del colera".

Uno degli autori principali del documento, Bruce Turnbull, PhD, della School of Chemistry e dell'Astbury Centre for Structural Molecular Biology presso l'Università di Leeds, ha aggiunto: "I glicani che sono davvero importanti per il nostro sistema immunitario e per altri processi biologici che ci mantengono sani, vengono sfruttati anche da virus e tossine per entrare nelle nostre cellule. Il nostro lavoro ci sta consentendo di comprendere come le proteine ​​umane e patogene abbiano modi diversi di interagire con lo stesso glicano. Ciò ci aiuterà a realizzare diagnosi e farmaci in grado di distinguere tra proteine ​​umane e patogene".

Lo studio fornisce la prova che i fluoro-zuccheri artificiali possono essere utilizzati per mettere a punto il riconoscimento di patogeni o biomarcatori o per scoprire nuovi farmaci. "Questa capacità convalidata del pattern di fluorurazione del glicano di fornire cambiamenti significativi nel legame proteico mantenendo la conformazione del glicano, annuncia grandi promesse per lo sviluppo di kit diagnostici o nuove terapie anti-adesione per combattere le infezioni microbiche", ha concluso il gruppo. "Prevediamo che i nostri dati preliminari che dimostrano l'applicazione dell'approccio del glicofluoroformio per il rilevamento del flusso laterale di una tossina batterica accelereranno lo sviluppo di diagnosi e terapie basate sul glicano".

Gibson ha inoltre spiegato a GEN che diversi membri del gruppo stanno espandendo i metodi ad altri glicani ed altri li stanno integrando in innovative piattaforme di rilevamento con nuove tecnologie di generazione del segnale. "In termini di aree ortogonali, l'integrazione specifica del sito del fluoro nei polisaccaridi potrebbe apportare reali benefici per realizzare materiali avanzati basati su piattaforme sostenibili", ha suggerito. C'è anche l'opportunità di utilizzare glicani fluorurati in aree biomediche come nuovi inibitori, basandosi sull'uso consolidato della fluorurazione nei farmaci clinicamente approvati. "Questo è uno dei motivi per cui siamo entusiasti: le strategie chemio-enzimatiche possono essere applicate ad una vasta gamma di altri glicani: ad esempio, nel nostro lavoro precedente abbiamo dimostrato che alcuni fluoro-glicani più piccoli potevano essere preparati ed avevano interazioni selettive con proteine ​​con potenziale diagnostico del cancro".

Gibson ha affermato: "Durante la pandemia di COVID-19, il nostro gruppo ha introdotto i primi test di flusso laterale che utilizzavano zuccheri al posto degli anticorpi come 'unità di riconoscimento'. Ma il limite è sempre quanto siano specifici e selettivi a causa della promiscuità degli zuccheri naturali. Ora possiamo integrare questi fluoro-zuccheri nelle nostre piattaforme di biosensing con l'obiettivo di avere una diagnostica economica, rapida e termicamente stabile adatta ad ambienti con poche risorse".

Ci sono un numero enorme di potenziali obiettivi diagnostici, dai batteri ai patogeni virali ai marcatori del cancro, ha aggiunto nei suoi commenti a GEN . "Vorrei anche sottolineare l'opportunità di questi nanosensori glicosilati per il biosensing, per supportare la ricerca o il monitoraggio di come gli agenti infettivi evolvono le loro preferenze di legame ai glicani, come durante la zoonosi influenzale... Il gruppo sta attualmente esaminando come questa tecnologia possa essere integrata in altre piattaforme di rilevamento, per espandersi oltre il flusso laterale, ma è anche entusiasta di entrare in contatto con le parti interessate agli eventi di legame ai glicani per il rilevamento/la diagnosi".

ENGLISH

Scientists have found a way to create artificial sugars that could lead to more accurate ways to diagnose and perhaps treat diseases. The collaboration of academic and industry scientists in Europe, including teams at the University of Manchester and the University of Leeds, developed a method to create “fluoro-sugars,” or “glycofluoroforms”—specific glycan sugars containing fluorine molecules—that could block pathogens. The team also demonstrated the potential diagnostic utility of their approach for detecting a bacterial toxin using lateral flow technology.

The study provides evidence that the artificial fluoro-sugars can be used to fine-tune pathogen or biomarker recognition or even to discover new drugs. They also offer an alternative to antibodies in low-cost diagnostics, which do not require animal tests to discover and are heat stable. “At Manchester, we are very interested, and currently exploring, how we can deploy natural and unnatural glycans in diagnostics,” said Matthew Gibson, PhD, a professor at the University of Manchester Institute of Biotechnology, speaking to GEN. “Our platform has several benefits such as not needing to use animal technologies to raise new antibodies, and the glycosylated nanoparticles are very stable against heat and other stressors so could find use in lower resource environments and for pandemic preparedness.”

eporting in their published paper in Nature Communications (“Synthesis and screening of a

 library of LewisX deoxyfluoro-analogues reveals differential recognition by glycan-binding partners,”) Gibson and colleagues wrote, “We anticipate that our preliminary data demonstrating application of the glycofluoroform approach for lateral flow detection of a bacterial toxin will accelerate the development of glycan-based diagnostics, and therapeutics.”

Sugars play a crucial role in human health and disease, far beyond being just an energy source. Complex sugars called glycans coat all our cells and are essential for healthy function. These sugars are also often hijacked by pathogens such as influenza, SARS-CoV-2, and cholera, to infect us. “Glycan-mediated interactions play a crucial role in biology and medicine, influencing signaling, immune responses, and disease pathogenesis,” the authors wrote, “… and significant advances have been made in understanding these processes through studies of the recognition of glycan sequences by glycan-binding proteins.”

However, the same glycan can bind to many different proteins, and this makes it difficult to use glycans as targets for precise diagnostics or therapeutic approaches. “… the use of glycans in biosensing and diagnostics is limited by cross-reactivity, as certain glycan motifs can be recognized by multiple biologically distinct protein receptors,” the team continued. “This raises the challenge of how one can develop small molecule probes for diagnostics or therapeutics that can distinguish between the interactions of different proteins with the same glycan.”

“LewisX is a glycan motif that is a ligand for recognition in numerous contexts with many different proteins,” the authors further explained. The trisaccharide is expressed, for example, on tumor cells, and on milk sugars (the authors cited studies indicating that it may protect against toxins and pathogens involved in some childhood diseases), and on the surface of some pathogens, including gastric cancer-causing Helicobacter pylori, and the parasite schistosoma mansoni, which causes schistosomiasis. “Given the

 biological importance of LewisX it would be desirable, for diagnostic and therapeutic purposes, to have chemical probes that could distinguish between each of the diverse proteins with which this glycan can interact,” the investigators further noted.

For their reported study, Gibson and colleagues used a combination of enzymes and chemical synthesis to create a library of 150

 LewisX glycofluoroforms, to which they had added fluorine atoms at specific sites. Fluorine is very small, which means that the resulting fluoro-sugars kept their same 3D shape, but the fluorines interfered with how proteins bind to them. The team then characterized and investigated 24 glycans from the library, which they incorporated into nanoparticles or microarrays, to see whether the different fluorination patterns were associated with

 binding by specific LewisX-binding proteins, including antibodies and bacterial toxins.

Kristian Hollie, PhD, who led the production of the fluoro-sugar library at the University of Leeds, said, “We used enzymes to rapidly assemble fluoro-sugar building blocks to make 150 different versions of a biologically important glycan. We were surprised to find how well natural enzymes work with these chemically modified sugars, which makes it a really effective strategy for discovering molecules that can bind selectively.”

Co-author Sabine Flitsch, PhD, a researcher from the Manchester Institute of Biotechnology at the University of Manchester, added, “One of the key technologies used in this work is biocatalysis, which uses enzymes to produce the very complex and diverse sugars needed for the library. Biocatalysis dramatically speeds up the synthetic effort required and is a much more green and sustainable method for producing the fluorinated probes that are required.”

The results of the researchers’ studies showed that some of the glycofluoroforms prepared could be used to detect the cholera bacteria toxin, indicating that they might be used in simple, low-cost tests, similar to lateral flow tests that are widely used for pregnancy, or SARS-CoV-2 testing. The authors reported, “… incorporation of a subset of these glycans into nanoparticles or a microarray revealed a striking spectrum of distinct binding intensities across different proteins that recognize LewisX … Overall, our microarray and nanoparticle binding studies reveal that different proteins with a

 LewisX binding site have distinctive recognition modes for this important trisaccharide.”

Gibson noted to GEN, “… my team previously filed patents on lateral flow glyco assays, showing how glycans can be introduced into gold particles to enable them as antibody alternatives in lateral flow. I anticipate there is quite a lot of space for innovation non-antibody-based diagnostics … In terms of clinical applications, early in the COVID-19 pandemic, my team led a collaboration to make a SARS-COV-2 rapid diagnostics based on glycans: we validated this in clinical samples showing good performance. The new work that we have published today is important to allow us to get more selectivity and specificity, and we did some model studies for cholera-toxin detection.”

One of the paper’s lead authors, Bruce Turnbull, PhD, from the School of Chemistry and Astbury Centre for Structural Molecular Biology at the University of Leeds, added, “Glycans that are really important for our immune systems, and other biological processes that keep us healthy, are also exploited by viruses and toxins to get into our cells. Our work is allowing us to understand how proteins from humans and pathogens have different ways of interacting with the same glycan. This will help us make diagnostics and drugs that can distinguish between human and pathogen proteins.”

The study provides evidence that the artificial fluoro-sugars can be used to fine-tune pathogen or biomarker recognition or to discover new drugs. “This validated ability of glycan fluorination patterning to deliver significant changes in protein binding whilst maintaining glycan conformation, heralds great promise for the development of diagnostic kits or new anti-adhesion therapies to combat microbial infections,” the team concluded. “We anticipate that our preliminary data demonstrating application of the glycofluoroform approach for lateral flow detection of a bacterial toxin will accelerate the development of glycan-based diagnostics, and therapeutics.”

Gibson further explained to GEN that several members of the team are expanding the methods to additional glycans, and others are integrating these into innovative sensing platforms with new signal generation technologies. “In terms of orthogonal areas, the site-specific integration of fluorine into polysaccharides could bring real benefits to make advanced materials based on sustainable platforms,” he suggested. There is also an opportunity to use fluorinated glycans in biomedical areas as new inhibitors, building on the established use of fluorination in clinically approved drugs. “This is part of why we are excited: the chemo-enzymatic strategies can be applied to a large range of other glycans: for example, in our earlier work we showed some smaller fluoro-glycans could be prepared and had selective interactions with proteins with cancer diagnostic potential.”

Gibson stated, “During the COVID-19 pandemic, our team introduced the first lateral flow tests which used sugars instead of antibodies as the ‘recognition unit.’ But the limit is always how specific and selective these are due to the promiscuity of natural sugars. We can now integrate these fluoro-sugars into our biosensing platforms with the aim of having cheap, rapid, and thermally stable diagnostics suitable for low-resource environments.”

There are a huge number of potential diagnostic targets from bacterial to viral pathogens to cancer markers, he added in his comments to GEN. “I would also stress the opportunity for these glycosylated nanosensors for biosensing, to support research or monitoring of how infectious agents evolve their glycan-binding preferences, such as during influenza zoonosis … The team is currently looking at how this technology can be integrated into other sensing platforms, to expand beyond lateral flow, but are also excited to connect to parties interested in glycan-binding events for sensing/diagnostics.”

Da:

https://www.genengnews.com/topics/drug-discovery/fluoro-sugars-sweeten-detection-and-treatment-of-microbial-pathogens/