La guarigione delle ferite croniche è facilitata dall'associazione di antibiotici e clorato per uccidere i patogeni / Chronic Wound Healing Aided When Antibiotic Combined with Chlorate to Kill Pathogen

La guarigione delle ferite croniche è facilitata dall'associazione di antibiotici e clorato per uccidere i patogeni / Chronic Wound Healing Aided When Antibiotic Combined with Chlorate to Kill Pathogen

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Melanie Spero ed il suo laboratorio presso l'Università dell'Oregon hanno scoperto che aggiungendo piccole dosi di una semplice molecola chiamata clorato agli antibiotici standard, la combinazione si è dimostrata 10.000 volte più efficace nell'uccidere le cellule batteriche in laboratorio rispetto agli antibiotici monofarmaco. Hanno testato la combinazione di farmaci sul batterio patogeno P. aeruginosa, che comunemente infetta le ferite croniche. / Melanie Spero and her lab at the University of Oregon have found that by adding small doses of a simple molecule called chlorate to standard antibiotics, the combination proved 10,000 times more effective at killing bacterial cells in the lab than single-drug antibiotics. They tested the drug combination on the pathogenic bacterium P. aeruginosa, which commonly infects chronic wounds.

I ricercatori dell'Università dell'Oregon (UO) hanno testato una nuova terapia farmacologica combinata che, secondo i risultati sperimentali, potrebbe smantellare i batteri difficili da trattare che popolano le infezioni croniche delle ferite. I risultati potrebbero contribuire allo sviluppo di trattamenti antimicrobici più efficaci che promuovono la guarigione delle ferite croniche. Tali trattamenti potrebbero anche contribuire a ridurre il rischio di infezioni gravi, come le ulcere del piede diabetico, che possono portare ad amputazioni.

L'approccio prevede l'associazione di farmaci noti da tempo che, da soli, hanno scarsa efficacia contro il batterio patogeno Pseudomonas aeruginosa, difficile da trattare e che si infetta nelle ferite croniche. Guidati da Melanie Spero, PhD, professoressa associata di biologia presso la Facoltà di Arti e Scienze dell'UO, i ricercatori hanno scoperto che la combinazione di terapia antibiotica con piccole dosi di clorato si è dimostrata 10.000 volte più efficace nell'uccidere le cellule batteriche in laboratorio rispetto agli antibiotici monofarmaco.

Quel livello di potenza ha anche ridotto la dose di farmaco necessaria per uccidere P. aeruginosa. E sebbene la ricerca sia stata condotta nel contesto delle infezioni croniche delle ferite, la strategia potrebbe rivelarsi promettente per affrontare la resistenza agli antibiotici in modo più ampio. "Penso che le combinazioni di farmaci saranno un approccio fondamentale che ci aiuterà a combattere l'aumento della resistenza agli antibiotici", ha affermato Spero. "Trovare esempi di sinergia tra antimicrobici già presenti sul mercato sarà davvero prezioso. E dovremo approfondire i meccanismi alla base della loro efficacia sinergica".

Se i risultati potessero essere applicati agli esseri umani, potrebbero contribuire a ridurre il tempo in cui i pazienti devono assumere antibiotici ed a ridurre i rischi di tossicità, ha aggiunto Spero, autore principale dello studio pubblicato dal team su Applied and Environmental Microbiology, intitolato " Hijacking anaerobic metabolism to restore antibiotic effectiveness in Pseudomonas aeruginosa ", in cui hanno concluso: "I nostri risultati dimostrano che il trattamento combinato clorato-antibiotico è promettente per combattere l'insuccesso del trattamento antibiotico in ambienti ospiti ipossici".

Una ferita cronica è un tessuto lesionato che non ha iniziato a guarire entro i normali tempi di guarigione, che vanno dalle quattro alle dodici settimane. Il tipo più comune è l'ulcera del piede diabetico, ha spiegato Spero, una piaga aperta sulla parte inferiore del piede che si forma a causa di cattiva circolazione, pressione prolungata e mancanza di sensibilità.

Secondo una ricerca pubblicata dall'American Diabetes Association, circa 1 persona su 4 con diabete di tipo 2 sviluppa un'ulcera al piede e più della metà di questi casi si infetta. "Un'infezione attiva è la complicanza più comune che impedisce alla ferita di guarire e chiudersi", ha affermato Spero, aggiungendo che, quando grave, 1'ulcera diabetica su 5 richiede un'amputazione. "È molto debilitante, ma non si sta conducendo molta ricerca microbiologica in questo campo. Quindi è un'opportunità per fare una grande differenza".

Le variazioni del flusso sanguigno, l'elevata richiesta di ossigeno da parte delle cellule infiammatorie e la presenza di batteri nel sito della ferita cronica limitano la quantità di ossigeno che raggiunge il tessuto, impedendone la guarigione. "I patogeni batterici incontrano abitualmente microambienti ipossici ed anossici all'interno del corpo umano", hanno scritto gli autori nel loro articolo. "Nelle ferite croniche, che colpiscono circa il 2% della popolazione statunitense, l'ipossia tissutale deriva da un apporto ematico insufficiente e dal consumo locale di O2 da parte di microbi e cellule immunitarie iperattive".

Queste condizioni di scarsa ossigenazione sono anche il problema che rende le infezioni batteriche difficili da combattere: smascherano la resistenza e la tolleranza agli antibiotici. "Molti antibiotici sono meno efficaci nell'uccidere i patogeni in condizioni di carenza di ossigeno (O2) ", ha continuato il gruppo. "Si ritiene che la relazione tra ipossia ambientale e fallimento del trattamento antibiotico sia alla base di diversi tipi di infezioni recalcitranti, tra cui infezioni croniche delle vie aeree da ferite e fibrosi cistica (FC). Le ferite croniche, inoltre, non possono guarire mentre è in corso un'infezione, ed il frequente fallimento dei trattamenti antibiotici nel risolvere le infezioni delle ferite può portare a complicazioni come l'amputazione degli arti.

Quando l'ossigeno disponibile in una ferita diventa insufficiente, i batteri possono ricorrere alla respirazione dei nitrati per ricavare energia, hanno spiegato ulteriormente gli scienziati. E mentre la crescita batterica rallenta in assenza di ossigeno, i batteri sopravvivono e continuano a diffondersi. "La respirazione dei nitrati è una forma diffusa di metabolismo energetico anaerobico che supporta la crescita o la sopravvivenza di molti patogeni in ambienti ipossici", hanno scritto gli autori.

La conseguente lenta crescita dei batteri, in particolare di P. aeruginosa, li rende notoriamente tolleranti agli antibiotici convenzionali. Questo perché molti farmaci vengono classificati in base alla loro efficacia nell'uccidere i batteri a crescita rapida, ha affermato Spero. Ma se i batteri crescono lentamente, quegli antibiotici, che spesso vengono testati solo in condizioni di elevata ossigenazione, finiscono per essere inefficaci, ha aggiunto. Almeno quando somministrati da soli, hanno ora scoperto Spero e colleghi. Quando gli antibiotici vengono combinati con una piccola molecola chiamata clorato, "stressano la cellula batterica in un modo che la rende estremamente suscettibile agli antibiotici", ha affermato Spero.

Durante la respirazione dei nitrati, la nitrato reduttasi riduce il nitrato (NO3−) a nitrito (NO2− ) . E sebbene esistano diversi tipi di nitrato reduttasi, ci sono "prove evidenti", ha continuato il team, che la respirazione dei nitrati mediata dall'enzima Nar supporti la sopravvivenza o la crescita del patogeno nell'ospite. "... abbiamo recentemente dimostrato che il patogeno opportunista Pseudomonas aeruginosa necessita di Nar per causare infezioni croniche persistenti delle ferite nei topi diabetici". I risultati di diversi studi, nel complesso, ha continuato il gruppo, indicano che "... la respirazione dei nitrati è un promettente bersaglio terapeutico per l'eliminazione dei patogeni in ambienti ospiti ipossici od anossici".

La ricerca appena pubblicata si basa su studi condotti da Spero come ricercatrice post-dottorato presso il California Institute of Technology. In precedenza, aveva scoperto che il clorato, un composto semplice ed innocuo per mammiferi ed esseri umani alle basse dosi utilizzate nei suoi studi, trasforma gli antibiotici da agenti poco efficaci in potenti killer batterici  in colture cellulari  e  modelli murini diabetici.

"È noto da decenni che il clorato è tossico per i batteri che respirano nitrato tramite Nar, perché questo enzima riduce il clorato generando la molecola di clorito, altamente tossica", ha proseguito il team nel loro rapporto appena

 pubblicato. "Il clorato (ClO 3 − ) è un analogo del nitrato che agisce come profarmaco: il clorato in sé è relativamente atossico, ma Nar può legarsi e

 ridurre il clorato generando clorito (ClO 2 − ), che è un agente ossidante tossico". I mammiferi sono privi di Nar, quindi "non sorprende" che il clorato abbia una bassa tossicità nei mammiferi, hanno aggiunto.

Attraverso il loro ultimo studio, Spero e colleghi hanno dimostrato che il clorato contribuisce a rendere tutti i tipi di antibiotici più efficaci nell'uccidere P. aeruginosa e può ridurre la dose di antibiotico necessaria per combattere il patogeno. Per la loro ricerca, si sono concentrati su diverse classi di antibiotici anti-pseudomonas, tra cui aminoglicosidi (tobramicina), fluorochinoloni (ciprofloxacina), beta-lattamici (cefalosporine: ceftazidima) e polimixine (colistina).

I loro risultati hanno mostrato che con una piccola quantità di clorato nella miscela, era possibile utilizzare solo l'1% della dose standard dell'antibiotico ad ampio spettro ceftazidima. "... abbiamo scoperto che il clorato potenzia tutti gli antibiotici testati", hanno affermato. E nonostante il trattamento con solo clorato abbia causato una mortalità minima o nulla delle colture ipossiche di P. aeruginosa, hanno sottolineato, l'aggiunta di clorato a ciascun trattamento antibiotico ha aumentato la mortalità di oltre quattro ordini di grandezza per tutte le classi di antibiotici testate. "Nel caso della ceftazidima, l'aggiunta di clorato ha ridotto la dose tossica di oltre 100 volte".

I ricercatori hanno anche riportato risultati promettenti: il clorato ha potenziato la terapia antibiotica contro tutti gli isolati clinici di P. aeruginosa testati. "Nel complesso, le combinazioni clorato-antibiotico superano la resistenza agli antibiotici, uccidendo vari isolati di P. aeruginosa in condizioni di carenza di O2", hanno affermato. Spero ha aggiunto: "Nel caso di infezioni croniche, le persone assumono spesso antibiotici per lunghi periodi di tempo, e questo può avere effetti devastanti sull'organismo", ha affermato Spero. "I farmaci ad alta tossicità possono alterare la flora intestinale ed avere gravi effetti collaterali. Qualsiasi cosa possiamo fare per ridurre la durata della terapia antibiotica e ridurne il dosaggio, meglio è".

I risultati provengono da test di laboratorio controllati su colture cellulari batteriche, quindi la traslazione clinica è ancora lontana. Soprattutto perché le infezioni croniche di solito non coinvolgono un singolo batterio, ha commentato Spero, poiché ospitano interi quartieri microbici che vivono ed interagiscono tra loro. Quindi, scoprire come le combinazioni di farmaci influenzino queste complesse comunità negli organismi modello è un ovvio passo successivo, ha aggiunto. Ciononostante, gli autori hanno scritto: "Questi risultati sottolineano il potenziale del clorato per migliorare l'efficacia dei trattamenti antibiotici in ambienti tipicamente caratterizzati da recalcitranza agli antibiotici".

Anche l'esatto meccanismo con cui il clorato potenzia l'azione degli antibiotici è ancora un mistero. Spero ha spiegato che gli scienziati sanno che il clorato dirotta la respirazione dei nitrati, quindi in completa assenza di ossigeno i microbi vengono eliminati. Ma in microambienti con bassi, o alti, livelli di ossigeno, i batteri possono in qualche modo riparare il danno e tollerare la sostanza chimica. Quindi, negli screening tradizionali per singoli farmaci, che di solito vengono eseguiti in condizioni di elevata ossigeno, il clorato è stato trascurato, ha osservato Spero.

"Penso che sia questo ciò che non comprendiamo appieno: i tipi di stress che questi composti impongono alla cellula, che sono invisibili a noi", ha affermato. "Se il nostro unico parametro di misura è la vitalità – i batteri sono sopravvissuti o sono morti? – è tutto ciò che cercheremo. Dobbiamo chiederci quali processi vengono sollecitati o stressati nella cellula che possono portarla al collasso in presenza di antibiotici".

Spero spera che osservare "sotto il cofano" di una cellula durante l'esposizione a clorato ed antibiotici mostrerà agli scienziati il ​​meccanismo biologico che determina la suscettibilità dei batteri ad una serie di antibiotici. "Il clorato è un candidato promettente per futuri studi volti a scoprire i meccanismi di potenziamento dei farmaci, perché ne aumenta l'efficacia in combinazione con farmaci con meccanismi d'azione diversi", ha sottolineato il gruppo nel suo articolo.

"Ciò avrà importanti implicazioni non solo per il trattamento delle infezioni croniche delle ferite, ma anche in senso più ampio per il campo delle malattie infettive e per la nostra lotta contro la resistenza agli antibiotici ed il fallimento terapeutico", ha commentato Spero. "Una volta compresi i meccanismi della sinergia tra farmaci, potremo iniziare a trovare altre molecole che inducono questi comportamenti sinergici, e non sarà più un gioco ad indovinelli in cui testiamo ogni possibile combinazione di farmaci. Potremo iniziare a progettare farmaci razionali, utilizzando molecole già approvate".

Gli autori hanno inoltre commentato: "In definitiva, gli stress cellulari imposti dai farmaci individualmente ed in combinazione inizieranno a far luce sui meccanismi della sinergia dei farmaci, il che migliorerà la nostra capacità di prevedere nuove potenti combinazioni di farmaci nella lotta contro il fallimento del trattamento antibiotico".

ENGLISH

University of Oregon (UO) researchers have tested a new combination drug therapy that experimental results suggest could dismantle the difficult-to-treat bacteria inhabiting chronic wound infections. The findings could help lead to the development of more effective antimicrobial treatments that promote healing in chronic wounds. Such treatments might also help to reduce the risk of severe infections, such as diabetic foot ulcers, that may lead to amputations.

The approach pairs long-known drugs that do little on their own against the hard-to-treat bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa festering in chronic wounds. Headed by Melanie Spero, PhD, an assistant professor of biology in the UO’s College of Arts and Sciences, the researchers found that combining antibiotic therapy with small doses of chlorate proved 10,000 times more effective at killing bacterial cells in the lab than single-drug antibiotics.

That level of potency also reduced the dose of medication required to kill P. aeruginosa. And while the research was carried out in the context of chronic wound infections, the strategy may hold promise for addressing antibiotic resistance more broadly. “I think that drug combinations will be a critical approach that helps us fight against the rise of antibiotic resistance,” Spero said. “Finding examples of synergy among antimicrobials that are already on the market is going to be really valuable. And we’ll need to dig further into the mechanisms behind why they work well together.”

If the findings can be translated to humans, they could help shorten the time patients need to be on antibiotics and lower the risks of toxicity, added Spero, who is senior author of the team’s published study in Applied and Environmental Microbiology, titled “Hijacking anaerobic metabolism to restore antibiotic efficacy in Pseudomonas aeruginosa,” in which they concluded, “Our results demonstrate that combined chlorate-antibiotic treatment holds promise for combating antibiotic treatment failure in hypoxic host environments.”

A chronic wound is injured tissue that hasn’t started to heal within normal time frames of four to 12 weeks. The most common type is a diabetic foot ulcer, Spero said, which is an open sore on the foot’s underside that forms from poor circulation, prolonged pressure, and a lack of sensation.

According to research published by the American Diabetes Association, about 1 in 4 people with type 2 diabetes develop a foot ulcer, and more than half of those cases become infected. “An active infection is the most common complication that prevents the wound from healing and closing,” Spero said, adding that when severe, 1 in 5 diabetic foot ulcers require an amputation. “It’s very debilitating, but there’s not a lot of microbiology research being done in this field. So it’s an opportunity to make a big difference.”

Shifts in blood flow, the high oxygen demand of inflammatory cells, and the presence of bacteria in the chronic wound site all limit how much oxygen reaches the tissue, preventing healing. “Bacterial pathogens routinely encounter hypoxic and anoxic microenvironments within the human body,” the authors wrote in their paper. “In chronic wounds, which affect ~2% of the U.S. population, tissue hypoxia stems from insufficient blood supply as well as local O2 consumption by microbes and overactive immune cells.”

Those low-oxygen conditions are also the very problem that makes bacterial infections hard to fight: They unmask antibiotic resistance and tolerance. “Many antibiotics are less effective at killing pathogens under oxygen (O2)-limited conditions,” the team continued. “The relationship between environmental hypoxia and antibiotic treatment failure is thought to underpin different types of recalcitrant infections, including chronic wound and cystic fibrosis (CF) airway infections.” Chronic wounds also cannot heal while there is an active infection, and the frequent failure of antibiotic treatments to resolve wound infections can lead to complications such as limb amputation.

When a wound site becomes oxygen-limited, bacteria can switch to nitrate respiration for energy, the scientists further explained. And while bacterial growth slows without oxygen, the bacteria still survive and continue to spread. “Nitrate respiration is a widespread form of anaerobic energy metabolism that supports the growth or survival of many pathogens in hypoxic host environments,” the authors wrote.

The resulting slow growth of the bacteria, particularly P. aeruginosa, makes them notoriously tolerant to conventional antibiotics. That’s because many medications are rated based on how well they kill fast-growing bacteria, Spero said. But if the bacteria are growing slowly, those antibiotics, which are also often tested only in oxygen-rich conditions, end up being ineffective, she said. At least when administered on their own, Spero and colleagues have now found. When the antibiotics are combined with the small molecule called chlorate, it “stresses the bacterial cell in a way that makes it super susceptible to antibiotics,” Spero said.

During nitrate respiration, nitrate reductase reduces nitrate (NO3−) to nitrite (NO2−). And while there are several types of nitrate reductase, there is “strong evidence”, the team continued, that nitrate respiration mediated by the enzyme Nar supports pathogen survival or growth in the host. “… we recently showed that the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa requires Nar to cause persistent chronic wound infections in diabetic mice.” The findings from multiple studies taken together, the team continued, indicate that “… nitrate respiration is a promising therapeutic target for killing pathogens in hypoxic or anoxic host environments.”

The newly reported research builds on studies Spero first conducted as a postdoctoral scholar at the California Institute of Technology. She previously found that chlorate, a simple compound that is harmless to mammals and humans in the low doses used in her studies, turns antibiotics from lukewarm performers into potent bacteria killers in cell cultures and diabetic mouse models.

“It has been known for decades that chlorate is toxic to bacteria that respire nitrate via Nar because this enzyme reduces chlorate to generate the highly toxic chlorite molecule,” the team continued in their newly released report. “Chlorate (ClO3−) is a nitrate analog that acts as a prodrug: chlorate itself is relatively nontoxic, but Nar can bind and reduce chlorate to generate chlorite (ClO2−), which is a toxic oxidizing agent.” Mammals lack Nar, so it is “unsurprising” that chlorate has low toxicity in mammals, they added.

Through their latest study, Spero and colleagues showed that chlorate works to make all kinds of antibiotics more effective at killing P. aeruginosa, and can lower the antibiotic dose needed to fight the pathogen. For their research, they focused on different classes of anti-pseudomonal antibiotics, including aminoglycosides (tobramycin), fluoroquinolones (ciprofloxacin), beta-lactams (cephalosporins: ceftazidime), and polymyxins (colistin).

Their results showed that with a small amount of chlorate in the mix, it was possible to use just 1% of the standard dose of the broad-spectrum antibiotic ceftazidime. “… we found that chlorate potentiates all tested antibiotics,” they stated. And despite chlorate-only treatment resulting in little-to-no killing of hypoxic P. aeruginosa cultures, they pointed out, the addition of chlorate to each antibiotic treatment increased killing by more than four orders of magnitude for all tested classes of antibiotics. “In the case of ceftazidime, chlorate addition reduced the toxic dose by >100-fold.”

Promisingly, the investigators also reported that chlorate potentiated antibiotic therapy against all P. aeruginosa clinical isolates tested. “Overall, chlorate-antibiotic combinations overcome antibiotic recalcitrance to kill various P. aeruginosa isolates under O2-limited conditions,” they stated. Spero added, “In the case of chronic infections, people are often on antibiotics for long periods of time, and that can wreak havoc on the body,” Spero said. “Drugs with high toxicities can disrupt gut microbes and have severe side effects. Anything we can do to shorten the amount of time that a person is going to be on antibiotics and lower the dosage, the better.”

The results come from controlled lab tests on bacterial cell cultures, so translation to the clinic is still far down the line. Especially since chronic infections usually don’t involve a single bacterium, Spero commented, as they host whole microbial neighborhoods living and interacting together. So uncovering how drug combinations affect those complex communities in model organisms is an obvious next step, she added. Nevertheless, the authors wrote, “These findings underscore the potential for chlorate to enhance the efficacy of antibiotic treatments in environments that are typically characterized by antibiotic recalcitrance.”

The exact mechanism for how chlorate boosts antibiotics is also still a mystery. Spero explained that chlorate has been known by scientists to hijack nitrate respiration, so in the complete absence of oxygen, microbes are wiped out. But in microenvironments of low—or high—levels of oxygen, the bacteria can somehow repair that damage and tolerate the chemical. So, in traditional single-drug screenings, which are usually performed in high-oxygen conditions, chlorate has been overlooked, Spero noted.

“I think that’s what we don’t fully appreciate: the types of stresses these compounds impose on the cell that are invisible to us,” she said. “If our only metric is viability—did the bacteria live or die?—that’s all we’ll look for. We need to be asking what processes are being pushed on or stressed out in the cell that can lead to its collapse in the presence of antibiotics.”

Spero hopes that looking “under the hood” of a cell during chlorate-antibiotic exposure will show scientists the biological machinery of how bacteria become susceptible to a range of antibiotics. “Chlorate is a promising candidate for pursuing future studies to uncover mechanisms of drug potentiation because it enhances killing in combination with drugs that have different mechanisms of action,” the team pointed out in their paper.

“This will have important implications not only for treating chronic wound infections but also broadly for the infectious disease field and our fight against antibiotic resistance and treatment failure,” Spero commented. “Once we understand the mechanisms of drug synergy, we can start to find other molecules that elicit these synergistic behaviors, and it won’t feel like a guessing game where we test every possible drug combination. We can start doing rational drug design, using molecules that have already been approved.”

The authors further commented, “Ultimately, the cellular stresses that drugs impose individually and in combination will begin to illuminate mechanisms of drug synergy, which will enhance our ability to predict powerful new drug combinations in the fight against antibiotic treatment failure.”

Da:

https://www.genengnews.com/topics/drug-discovery/chronic-wound-healing-aided-when-antibiotic-combined-with-chlorate-to-kill-pathogen/?_hsenc=p2ANqtz-8HPbJTMT9VeIBSIUVZ5PHuLZkJ25NiJLV-EY8tQrrz935YcClhVuQLWQ_QcI7vGYmaWWbimZ6Z9f1Sqo8NyDnTMEpzUfLZYtvAWU5BsxJow9G6A8U&_hsmi=382758471