Valutazione ad alto rendimento dello screening neonatale basato sulla metilazione di FMR1 e SNRPN utilizzando i sistemi IsoPure e QIAcube HT / High-throughput assessment of FMR1 and SNRPN methylation-based newborn screening using IsoPure and QIAcube HT systems

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

David Godler è il responsabile del laboratorio di diagnosi e sviluppo presso il Murdoch Children's Research Institute (MCRI; Parkville, Australia). In questo ruolo, David ha sviluppato diversi approcci per applicazioni diagnostiche e di screening. Il suo laboratorio ha condotto diversi studi di coorte unici sulle malattie rare, che hanno contribuito a far progredire la nostra comprensione di molti aspetti della sindrome dell'X fragile (FXS) e dei disturbi dell'imprinting del cromosoma 15. Ha inoltre condotto uno dei più grandi studi al mondo sulla prevalenza della FXS e dei disturbi dell'imprinting del cromosoma 15, fornendo prove a supporto dell'espansione delle attuali pratiche di screening neonatale per queste condizioni.

David è anche il fondatore e responsabile dell'Australian Biobank for Chromosome 15 Imprinting Disorders ed il responsabile del programma di screening neonatale Ep-iGenomic ( EpiGNs ), che ha condotto uno studio di coorte di nascita su tutto lo stato chiamato Gen V per indagare i vantaggi di un flusso di lavoro esteso di screening neonatale epigenomico, sviluppato dal suo gruppo.

Qui, David spiega le motivazioni alla base del suo recente articolo sui metodi, pubblicato su Epigenomics, in cui valuta l'uso del suo nuovo flusso di lavoro basato sulla robotica per lo screening della FXS e dei disturbi dell'imprinting del cromosoma 15.

Si prega di fornire un breve riassunto del documento

Neonati e bambini vengono sottoposti a test di routine per una serie di malattie genetiche e molti di questi test prevedono l'analisi dei modelli di metilazione del DNA. In questo studio, il primo al mondo, abbiamo confrontato l'efficacia di due procedure robotiche per test quantitativi ad alto rendimento per le alterazioni della metilazione del DNA associate a diverse malattie rare.

Abbiamo analizzato il sangue di neonati e bambini imbevuti su carte assorbenti, utilizzando queste due procedure ad alto rendimento per rilevare queste alterazioni della metilazione. I campioni di sangue su queste carte provenivano da soggetti con FXS od un disturbo dell'imprinting del cromosoma 15, oppure da soggetti che non presentavano nessuna di queste condizioni.

Entrambe le procedure hanno funzionato altrettanto bene su campioni più freschi per identificare correttamente gli individui affetti, ma una procedura, che utilizza un robot chiamato IsoPure, ha funzionato meglio su campioni di sangue più vecchi.

Cosa ti ha ispirato a sviluppare questo nuovo metodo?

Esiste una forte necessità di aumentare la produttività e di ridurre i costi nei test su larga scala in generale, ma questa esigenza è ancora più sentita nello screening neonatale a causa dell'ulteriore fattore di confondimento rappresentato dalla disponibilità limitata di materiale per la determinazione del sangue. Prima di questo studio, abbiamo identificato diversi potenziali vantaggi del robot IsoPure rispetto al QIAcube HT, che abbiamo utilizzato nei nostri studi precedenti. Questi vantaggi includono il risparmio sui costi associato al minor utilizzo di utensili in plastica, poiché il sistema IsoPure non richiede puntali, oltre al fatto che l'approccio IsoPure offre una produttività doppia rispetto al sistema QIAcube HT per la conversione del bisolfito.

Ma la cosa più importante è che il robot QIAcube HT necessita di una cappa aspirante con aspirazione esterna, a causa dei lavaggi sotto vuoto delle colonne, che generano aerosol di sostanze chimiche utilizzate nella procedura.

Questo non è il caso delle conversioni basate su biglie magnetiche utilizzate da IsoPure. Pertanto, il nostro obiettivo principale in questo studio era determinare se i parametri di performance dello screening con il metodo a biglie magnetiche IsoPure fossero uguali o migliori di quelli ottenuti utilizzando il sistema QIAcube HT basato su colonna, sul limitato materiale di riferimento disponibile per lo screening neonatale.

Quale impatto speri che avrà sui ricercatori di laboratorio?

Per noi, i risultati dello studio offrono l'opportunità di utilizzare un test di screening di primo livello migliorato nel programma EpiGNs, che mira a sottoporre a screening 100.000 neonati di Victoria, in Australia, per diverse malattie genetiche rare, tra cui la FXS ed i disturbi dell'imprinting del cromosoma 15.

Più in generale, i risultati offrono nuove opportunità per l'analisi automatizzata di DNA, che potrebbe essere di quantità e qualità limitate, al fine di rilevare numerose patologie associate ad alterazioni della metilazione del DNA. Questo potrebbe aiutare ricercatori, scienziati e clinici ad individuare e diagnosticare diverse patologie, prendendo di mira la metilazione del DNA come parte di una metodologia ad alto rendimento ed a basso costo.

Hai qualche suggerimento sulle migliori pratiche per i ricercatori che intendono utilizzare questo metodo?

La metodologia è sorprendentemente semplice e richiede poca formazione aggiuntiva o spazio aggiuntivo in laboratorio. La macchina IsoPure è piuttosto compatta rispetto ad altri robot utilizzati nel nostro laboratorio. Uno dei miei consigli per le migliori pratiche sarebbe quello di assicurarsi che i materiali pre- e post-PCR siano tenuti separati per ridurre al minimo il potenziale di contaminazione. Questo è molto importante per le applicazioni ad alta produttività, come lo screening neonatale, che utilizzano la metodologia descritta in questa pubblicazione. È inoltre molto importante assicurarsi che le soluzioni di lavoro siano pre-aliquotate prima di essere congelate e che le piastre di conversione al bisolfito non siano sottoposte a più di un ciclo di congelamento-scongelamento.

Cosa speri di fare in futuro in questo ambito?

Nei prossimi 3 anni, contiamo di completare l'ambito di lavoro previsto per il pannello iniziale di patologie che abbiamo sottoposto a screening su 100.000 neonati australiani nell'ambito del programma EpiGNs, per dimostrare la fattibilità di questo approccio su scala di popolazione. Ciò si rivelerà essenziale affinché questi approcci possano essere presi in considerazione per l'inclusione nello standard di cura per lo screening neonatale in futuro.

Parallelamente, stiamo lavorando per ampliare il pannello di patologie sottoposte a screening. Esistono oltre 120 malattie rare in cui alterazioni della sequenza del DNA sono associate a cambiamenti nella metilazione del DNA. Pertanto, prevediamo di utilizzare l'approccio ad alto rendimento descritto in questo articolo sui metodi per nuove applicazioni di screening e diagnosi in molte di queste patologie.

Alcune delle condizioni analizzate nel programma EpiGNs, come la sindrome di Angelman, hanno trattamenti attualmente in fase II/III di sperimentazione clinica. Tuttavia, questi studi sono in genere condotti su bambini più grandi, poiché l'attuale standard di cura per queste condizioni si basa sul riconoscimento dei sintomi, ritardando la diagnosi fino all'età adulta dei pazienti. Se si riuscisse a stabilire un approccio di screening validato per queste condizioni, potremmo identificare i neonati affetti da queste patologie prima che i sintomi diventino evidenti. Ciò consentirebbe di coinvolgere i neonati in futuri studi clinici, massimizzando i potenziali benefici per loro e migliorando potenzialmente le prestazioni di questi studi nei partecipanti più giovani.

Tra gli altri incarichi ricoperti da David figurano la cattedra di professore associato presso il Dipartimento di Pediatria dell'Università di Melbourne e il Dipartimento di Pediatria della Monash University (entrambi a Melbourne, Australia).

ENGLISH

David Godler is the group leader of the diagnosis and development laboratory at the Murdoch Children’s Research Institute (MCRI; Parkville, Australia). In this role, David has developed different approaches for diagnostic and screening applications. His lab has conducted several unique rare disease cohort studies, which have driven forward our understanding of many aspects of fragile X syndrome (FXS) and chromosome 15 imprinting disorders. He has also led one the world’s largest prevalence studies for FXS and chromosome 15 imprinting disorders, providing evidence to support the expansion of current newborn screening practices for these conditions.

David is also the founder and leader of the Australian Biobank for Chromosome 15 Imprinting Disorders and the lead of the Ep-iGenomic Newborn screening (EpiGNs) program, screening a whole-of-state birth cohort study called Gen V to investigate the benefits of an extended epigenomic newborn screening workflow, developed by his group.

Here, David explains the motivations behind his recent methods paper, published in Epigenomics, evaluating the use of his new robotics-based workflow to screen for FXS and chromosome 15 imprinting disorders.

Please provide a short summary of your paper

Newborns and children are routinely tested for a range of genetic diseases and many of these tests involve the analysis of DNA methylation patterns. In this world-first study, we compared how well two procedures featuring robotics could be used for high-throughput quantitative testing for changes in DNA methylation associated with different rare diseases.

We tested blood from infants and children soaked onto absorbent cards, using these two high-throughput procedures to detect these methylation changes. The blood samples on these cards were taken from participants with FXS or a chromosome 15 imprinting disorder, or from participants with neither of these conditions.

Both procedures worked equally well on fresher samples to correctly identify affected individuals, but one procedure, utilizing a robot called IsoPure, worked better on older blood samples.

What inspired you to develop this new method?

There is a great need for increased throughput and cost savings in large-scale testing across the board, but this need is increased in newborn screening due to the added confound of the limited blood spot material available. In advance of this study, we identified several potential advantages of the IsoPure robot compared to the QIAcube HT, which we have used in our earlier studies. These advantages include the cost savings associated with decreased use of plasticware, as no tips are required for the IsoPure system, alongside the fact that the IsoPure approach delivers a throughput double that of QIAcube HT system for bisulfite conversion.

Most importantly, however, the QIAcube HT robot requires a fumehood with external suction, due to the vacuum-based washes of columns, which generate aerosols of chemical used in the procedure.

This is not the case with the magnetic bead-based conversions utilized by IsoPure. Thus, our primary objective in this study was to determine if screening performance parameters with the IsoPure magnetic-bead method were the same or better than those using the column-based QIAcube HT system on the limited blood spot material available to us for newborn screening.

What impact do you hope it will have on laboratory researchers?

For us, the study results provide an opportunity to use an improved first-tier screening test in the EpiGNs program, which aims to screen 100,000 infants from Victoria, Australia, for several rare genetic conditions, including FXS and chromosome 15 imprinting disorders.

More broadly, the results provide new opportunities for automated testing of DNA that may be of limited quantity and quality, to detect many different diseases associated with changes to DNA methylation. This has the potential to help researchers, medical scientists and clinicians to screen and diagnose different diseases by targeting DNA methylation as part of a high-throughput low-cost methodology.

Do you have any tips for best practice for researchers looking to use this method?

The methodology is surprisingly straightforward, requiring little additional training or additional laboratory space. The IsoPure machine is quite compact compared to other robotics used in our lab. One of my tips for best practice would be to make sure that pre- and post-PCR materials are kept separated to minimize the potential for contamination. This is very important for high-throughput applications, such as newborn screening, which use the methodology described in this publication. Making sure that working solutions are pre-aliquoted prior to being frozen and that bisulfite-conversion plates are not subjected to more than one freeze-thaw cycle is also quite important.

What are you hoping to do next in this area?

In the next 3 years, we hope to complete the scope of work planned for the initial panel of conditions we have screened for on 100,000 Australian infants in the EpiGNs program to demonstrate the feasibility of this approach at a population scale. This will prove essential for these approaches to be considered for inclusion in the standard of care for newborn screening in the future.

In parallel, we are working on expanding the panel of conditions screened. There are over 120 rare diseases where changes in DNA sequence are associated with changes to DNA methylation. So, we are planning to utilize the high-throughput approach described in this methods paper for new screening and diagnostic applications in many of these conditions.

Some the conditions screened in the EpiGNs program, like Angelman syndrome, have treatments currently in Phase II/III clinical trials. However, these trials are typically conducted in older children as the current standard of care testing for these conditions relies on the recognition of symptoms, delaying diagnosis until patients are older. If a validated screening approach for these conditions can be established, then we could identify infants affected with these conditions before symptoms become apparent. This would allow for infants to be involved in future clinical trials, maximizing the potential benefits to them and potentially improving the performance of these trials in younger participants.

David’s further positions include Assistant Professorships at the Department of Paediatrics, University of Melbourne and the Department of Paediatrics, Monash University (both Melbourne, Australia).

Da:

https://www.biotechniques.com/molecular-biology/peek-behind-the-paper-high-throughput-assessment-of-fmr1-and-snrpn-methylation-based-newborn-screening-using-isopure-and-qiacube-ht-systems/?utm_campaign=BioTechniques%20-%20Weekly%20NL&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz-_TU0y5pCRpciHjrzXs6ZTFBixzSh-MsyiX5N2A4D8LqlD3xBzS0VqI-QGXghbHscsONAj4fkpiD2piJgmW0os9s5LznfRQgcU2xOk7Nm0qYP48Xf0&_hsmi=382638059&utm_content=382451834&utm_source=hs_email

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