Accelerare la sicurezza: come la ddPCR sta cambiando i test sul micoplasma / Speeding Up Safety: How ddPCR Is Changing Mycoplasma Testing

Accelerare la sicurezza: come la ddPCR sta cambiando i test sul micoplasma / Speeding Up Safety: How ddPCR Is Changing Mycoplasma Testing

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Scopri come la ddPCR sta rimodellando la gestione del rischio di contaminazione con la rapida rilevazione del micoplasma nel controllo di qualità biofarmaceutico.

Le terapie cellulari ed altri prodotti biologici avanzati hanno trasformato il panorama farmaceutico, ma hanno anche introdotto nuove sfide per il controllo di qualità (QC). Una minaccia persistente alla sicurezza e all'efficacia dei prodotti terapeutici è il rischio di contaminazione da micoplasma.

Con la crescente diffusione dei medicinali per terapie avanzate (ATMP) con breve durata di conservazione, è cresciuta la necessità di metodi di rilevamento della contaminazione più rapidi e affidabili. Per soddisfare queste esigenze, i laboratori di controllo qualità si stanno rivolgendo a strumenti molecolari come la PCR digitale a goccia (ddPCR), che offre tempi di risposta più rapidi, maggiore sensibilità ed una migliore resistenza agli inibitori della PCR rispetto ai metodi di coltura tradizionali.

Technology Networks ha recentemente parlato con la Dott.ssa Denise Teber, esperta scientifica in biologia molecolare presso i Charles River Laboratories, per saperne di più su come la ddPCR viene utilizzata per migliorare la gestione del rischio di contaminazione. 

Kate Robinson (KR):Cosa determina la richiesta di un rilevamento rapido ed affidabile del micoplasma?

Denise Teber, PhD (DT): Le contaminazioni da micoplasma rappresentano una minaccia costante per i processi di produzione basati sulle cellule. Sono privi di parete cellulare ed appartengono ad una delle classi di batteri più piccole conosciute. Queste caratteristiche li rendono difficili da filtrare durante la produzione farmaceutica. Le contaminazioni da micoplasma durante il processo produttivo possono alterare la qualità del prodotto e alcune specie sono in grado di infettare l'uomo.

Inoltre, il cambiamento dei prodotti farmaceutici sta alimentando la domanda di metodi più rapidi, che richiedono un volume di campione inferiore, soprattutto dopo l'introduzione sul mercato degli ATMP. Le terapie cellulari, ad esempio, hanno una breve durata di conservazione e quindi richiedono analisi più rapide di quelle che il metodo colturale può fornire. Questo è fondamentale per poter fornire il prodotto terapeutico ai pazienti in tempo.

In generale, per il rilascio di lotti commerciali, i tempi di conservazione prolungati dovuti a test di controllo qualità incompleti comportano costi aggiuntivi per ogni giorno in cui il lotto di produzione non può essere rilasciato.

KR: Quale ruolo svolge la ddPCR nel migliorare le strategie di gestione del rischio di contaminazione?

DT: Il lavoro di laboratorio per la ddPCR può essere completato in un giorno; può anche essere utilizzato per implementare test in fasi successive del prodotto per consentire una rilevazione precoce del micoplasma nel processo produttivo, con conseguente risparmio di tempo e denaro. Inoltre, a differenza dei metodi qPCR, la ddPCR è ancora più sensibile (possono essere rilevate 2 copie del genoma/reazione o 1 CFU/mL) e meno soggetta agli inibitori della PCR. Pertanto, gli effetti matrice del materiale campione, che possono portare all'inibizione della PCR, hanno un impatto meno significativo sulla rilevazione del micoplasma e dei mollicutes correlati. Pertanto, il rischio di risultati falsi negativi è ulteriormente ridotto.

KR: Quali sono i vantaggi dello screening basato sulla PCR  rispetto ai metodi tradizionali?

DT: Sono richiesti tempi di risposta significativamente più brevi e volumi di campione inferiori. I prodotti AAV sono spesso prodotti su scala molto più ridotta rispetto, ad esempio, ai prodotti anticorpali. È auspicabile ridurre il più possibile il volume del campione da sottoporre a test di controllo qualità.

I metodi basati sulla PCR possono anche rilevare una gamma più ampia di specie di mollicutes se vengono applicati diversi set di primer-sonda. Alcune specie non crescono in condizioni di coltura standard, motivo per cui viene applicato anche il metodo della coltura indicatrice. Tuttavia, questo metodo ha una sensibilità inferiore rispetto al metodo di coltura per alcune specie. Mentre i metodi basati sulla PCR solitamente rilevano più di 100 specie, i metodi tradizionali rilevano solo le specie che favoriscono le condizioni di coltura. 

KR: In che modo il test rapido ddPCR sul micoplasma si integra nei processi di controllo qualità esistenti?

DT: Può sostituire i metodi tradizionali (metodo della coltura e delle cellule indicatrici) previa adeguata validazione. Potrebbe essere richiesto anche uno studio di comparabilità. Se è in atto una validazione generica, è possibile ridurre il numero di specie di micoplasma da includere nella validazione specifica del prodotto. È necessario effettuare una valutazione del rischio, tenendo conto del prodotto, del processo produttivo e delle materie prime introdotte, per scegliere i ceppi di riferimento corretti da includere nella validazione specifica del prodotto. 

KR: Hai ricevuto feedback dai primi utilizzatori nei laboratori di controllo qualità biofarmaceutici?

DT: Non ancora, siamo ancora nella fase di validazione del metodo ddPCR, ma dopo un'adeguata validazione specifica per il prodotto, il nostro attuale metodo qPCR è già stato accettato dagli enti regolatori. Le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici (NAT), come qPCR e ddPCR, sono menzionate come un'alternativa idonea sia dalla Farmacopea Europea ( capitolo 2.6.7 ) che dalla Farmacopea Statunitense ( capitolo 63 ). Il NAT applicato deve essere validato e in grado di rilevare almeno 10 CFU/mL o meno per poter essere utilizzato in sostituzione di entrambi i metodi tradizionali. Inoltre, è necessario valutare la robustezza del metodo e eseguire test di specificità per escludere il rilevamento aspecifico da parte del NAT applicato di specie batteriche strettamente correlate come Clostridium, Lactobacillus o Streptococcus.

ENGLISH

Find out how ddPCR is reshaping contamination risk management with rapid mycoplasma detection in biopharma quality control.

Cell-based therapies and other advanced biologics have transformed the pharmaceutical landscape, but they’ve also introduced new challenges for quality control (QC). One persistent threat to the safety and efficacy of therapeutic products is the risk of mycoplasma contamination.

As advanced therapy medicinal products (ATMPs) with short shelf lives become more prevalent, the need for faster, more reliable contamination detection methods has grown. To meet these demands, quality control labs are turning to molecular tools like droplet digital PCR (ddPCR), which offers faster turnaround, higher sensitivity and better resistance to PCR inhibitors compared to traditional culture methods.

Technology Networks recently spoke with Dr. Denise Teber, a scientific expert in molecular biology at Charles River Laboratories, to learn more about how ddPCR is being used to improve contamination risk management. 

Kate Robinson (KR): What is driving the demand for rapid and reliable mycoplasma detection?

Denise Teber, PhD (DT): Mycoplasma contaminations are a constant threat for cell-based production processes. They lack a cell wall and belong to one of the smallest classes of bacteria known. These attributes make them difficult to filter out during pharmaceutical manufacturing. Mycoplasma contaminations during the production process can alter product quality, and some species are able to infect humans.

Furthermore, the change of drug products is also driving the demand for faster methods, which require a smaller sample volume, especially since the introduction of ATMPs to the market. Cell therapeutics, for example, have a short shelf life and thus require faster testing than the culture method can deliver. This is critical to be able to provide the therapeutic product to the patients in time.

In general, for commercial batch release, prolonged storage times due to incomplete QC testing is accompanied by additional costs for each day the production batch cannot be released.

KR: What role does ddPCR play in improving contamination risk management strategies?

DT: The laboratory work for ddPCR can be completed within one day; it can also be used to implement testing at additional product stages to enable an earlier detection of mycoplasma in the production process, which in the end could save time and money. Furthermore, in contrast to qPCR methods, ddPCR is even more sensitive (2 genome copies/reaction or 1 CFU/mL can be detected) and less prone to PCR inhibitors. Thus, matrix effects of the sample material, which can lead to PCR inhibition, have a less significant impact on the detection of mycoplasma and related mollicutes. Therefore, the risk of false negative results is further minimized.

KR: What are the advantages of PCR-based screening over traditional methods?

DT: Significantly shorter turnaround times and smaller sample volumes are required. AAV products are often produced on a much smaller scale than e.g., antibody products. It is desirable to reduce the sample volume, which has to be submitted to QC testing as much as possible.

PCR-based methods can also detect a broader range of mollicutes species if various primer–probe sets are applied. Some species do not grow under standard culture conditions, which is why the indicator culture method is applied in addition. This method however has a lower sensitivity than the culture method for some species. While PCR-based methods usually detect more than 100 species, the traditional methods only detect those species in favor of the culture conditions. 

KR: How does rapid ddPCR mycoplasma testing integrate into existing QC pipelines?

DT: It can replace the traditional methods (culture and indicator cell method) after suitable method validation. A comparability study might be required in addition. If a generic validation is in place, the number of mycoplasma species that need to be included in the product-specific validation can be reduced. A risk assessment considering the product, the production process and the introduced raw materials should be performed to choose the correct reference strains to be included in the product-specific validation. 

KR: Have you received any feedback from early adopters in biopharma QC labs?

DT: Not yet, we are still in the validation phase for the ddPCR method, but after a suitable product-specific validation, our current qPCR method has already been accepted by regulatory bodies. Nucleic acid amplification techniques (NATs), like qPCR and ddPCR, are mentioned as a suitable alternative by both the European Pharmacopoeia (chapter 2.6.7) and the United States Pharmacopeia (chapter 63). The applied NAT needs to be validated and able to detect at least 10 CFU/mL or less to be used as a replacement for both traditional methods. In addition, the robustness of the method should be evaluated and specificity testing should be performed to exclude unspecific detection by the applied NAT of closely related bacterial species like Clostridium, Lactobacillus or Streptococcus.

Da:

https://www.technologynetworks.com/biopharma/blog/speeding-up-safety-how-ddpcr-is-changing-mycoplasma-testing-405344

Da:

https://www.technologynetworks.com/biopharma/blog/speeding-up-safety-how-ddpcr-is-changing-mycoplasma-testing-405344