CRISPR ottiene un mantello dell'invisibilità / CRISPR Gets an Invisibility Cloak
CRISPR ottiene un mantello dell'invisibilità / CRISPR Gets an Invisibility Cloak
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Il sistema immunitario svolge un ruolo cruciale nella lotta contro tumori e metastasi. Di conseguenza, è fondamentale condurre ricerche sul cancro su modelli murini con un sistema immunitario il più naturale possibile, il che è più facile a dirsi che a farsi.
Grazie alla tecnologia CRISPR/Cas9, i ricercatori possono creare rapidamente un pool di centinaia di cellule tumorali, ciascuna con un gene silenziato. Trapiantandole nei topi, diventa evidente quale di questi geni silenziati influenza lo sviluppo e la diffusione del cancro. Grazie a questi screening CRISPR, gli scienziati sono in grado di identificare approcci preziosi per lo sviluppo di nuove terapie.
Ma il metodo presenta un inconveniente. I componenti di CRISPR/Cas9 provengono principalmente da batteri, con il risultato che vengono riconosciuti come estranei dal sistema immunitario dei topi ed attaccati. I ricercatori sospettano che questa reazione distorca i risultati degli screening CRISPR.
Il gruppo di ricerca guidato da Nicola Aceto, professore di Oncologia Molecolare al Politecnico Federale di Zurigo, ha ora dimostrato per la prima volta in dettaglio che è proprio così. Allo stesso tempo, il gruppo ha presentato un'elegante soluzione al problema: una strategia speciale che ricopre CRISPR/Cas9 con una sorta di involucro molecolare, rendendolo invisibile al sistema immunitario. I risultati sono stati appena pubblicati sulla rivista Cell .
I componenti batterici interferiscono
Inizialmente, i ricercatori hanno utilizzato modelli murini ben caratterizzati per vari tipi di cancro per studiare l'effetto dei componenti batterici di CRISPR/Cas9 sulla formazione di tumori e metastasi.
Hanno scoperto che le cellule tumorali impiantate nei topi venivano rigettate più spesso e risultavano geneticamente meno eterogenee in presenza di componenti CRISPR/Cas9. Inoltre, si formavano meno metastasi. Di conseguenza, la risposta del sistema immunitario impediva la normale progressione del cancro nei modelli animali. "Siamo rimasti sorpresi da quanto questo possa distorcere significativamente i risultati degli screening CRISPR", ha affermato Massimo Saini, primo autore dello studio e ETH Pioneer Fellow nel gruppo di Aceto.
Mantello dell'invisibilità per schermi
In risposta a questa situazione, il gruppo dell'ETH ha ora sviluppato un metodo alternativo per lo screening CRISPR/Cas9 che non innesca praticamente alcuna risposta immunitaria. Per raggiungere questo obiettivo, i ricercatori hanno esposto le cellule tumorali alla forbice genica batterica Cas9 solo temporaneamente. Inoltre, hanno sviluppato un metodo per isolare solo le cellule tumorali in cui un gene era stato silenziato con successo. Queste cellule non contenevano più Cas9 od altri elementi che avrebbero potuto innescare una risposta immunitaria.
Hanno anche scambiato i cosiddetti geni reporter. Si tratta di geni che vengono incorporati nel materiale genetico delle cellule tumorali negli screening CRISPR al posto dei geni silenziati. Successivamente, il prodotto di questi geni consente ai ricercatori di tracciare le cellule tumorali modificate nei topi. Invece dei classici geni reporter, che provengono da vari organismi, ora viene utilizzato un nuovo gene il cui prodotto differisce solo minimamente da una proteina prodotta naturalmente nei topi. Questo gli permette di passare inosservato, per così dire, e di non essere rilevato dal sistema immunitario.
"Abbiamo sviluppato un metodo per eseguire screening CRISPR su topi con sistema immunitario intatto, senza incorrere in effetti collaterali indesiderati", riassume il Prof. Aceto. L'aspetto ingegnoso di questo sistema è la sua versatilità e la possibilità di utilizzarlo anche su topi umanizzati, ovvero animali dotati di un sistema immunitario umano. "Questo è il metodo più simile possibile ai pazienti oncologici". Inoltre, il mantello dell'invisibilità delle forbici genetiche è adatto anche per applicazioni nella medicina personalizzata o per la ricerca sulle malattie autoimmuni.
"Con questo sistema stiamo raggiungendo un nuovo livello di precisione e, cosa particolarmente significativa per noi, siamo in grado di scoprire nuovi bersagli per le terapie", afferma Saini.
Scoperti geni trascurati per la formazione delle metastasi
Il gruppo ha già eseguito uno screening CRISPR con la versione mascherata delle forbici genetiche e ha ottenuto un risultato molto promettente: il silenziamento di due geni chiamati AMH e AMHR2 ha ridotto drasticamente il numero di metastasi in un modello murino di cancro al seno.
Ulteriori studi hanno dimostrato che la via di segnalazione in cui sono coinvolti questi due geni è clinicamente rilevante. Ad esempio, la valutazione dei dati dei pazienti ha rivelato che livelli elevati di proteina AMH nel tumore sono associati a recidive più frequenti ed ad una maggiore mortalità nel cancro al seno. Di conseguenza, la coppia genica AMH/AMHR2 rappresenta un nuovo approccio per combattere le metastasi.
"L'importanza di questo percorso di segnalazione è stata sottovalutata", afferma Aceto. "Grazie a CRISPR in modalità invisibile, ora siamo in grado di scoprire connessioni che prima erano nascoste."
ENGLISH
Scientists created an immunity-proof CRISPR system that reveals hidden metastasis genes in mouse tumour models.
The immune system plays a crucial role in fighting tumours and metastases. Consequently, it is decisive to conduct cancer research in mouse models with an immune system that is as natural as possible – which is easier said than done.
Thanks to CRISPR/Cas9 technology, researchers can quickly create a pool of hundreds of tumour cells, each with a different gene switched off. When transplanted into mice, it becomes apparent which of these silenced genes influences the development and spread of cancer. Assisted by such CRISPR screens, scientists are able to identify valuable approaches for the development of new therapies.
But the method comes with a catch. The components of CRISPR/Cas9 originate mainly from bacteria, with the result that they are recognised as foreign by the immune system of mice and attacked. Researchers suspect that this reaction distorts the results of CRISPR screens.
The research group headed by Nicola Aceto, Professor of Molecular Oncology at ETH Zurich, has now demonstrated in detail for the first time that this is indeed the case. At the same time, the team has presented an elegant solution to the problem – a special strategy that lays a kind of molecular cloak over CRISPR/Cas9, making it invisible to the immune system. The results have just been published in the journal Cell.
Bacterial components interfere
Initially, the researchers used well-characterised mouse models for various types of cancer to investigate the effect of the bacterial components of CRISPR/Cas9 on the formation of tumours and metastases.
They found that tumour cells implanted in mice were rejected more often and were genetically less heterogeneous in the presence of CRISPR/Cas9 components. In addition, fewer metastases formed. Consequently, the immune system's response prevented the normal progression of cancer in the animal models. "We were surprised at how significantly this can distort the results of CRISPR screens," as Massimo Saini, first author of the study and ETH Pioneer Fellow in Aceto's group, stated.
Invisibility cloak for screens
In response to this situation, the ETH team has now developed an alternative method for CRISPR/Cas9 screens that triggers virtually no immune response. In order to achieve this, the researchers exposed the tumour cells to the bacterial gene scissors Cas9 only temporarily. Moreover, they developed a method to isolate only those tumour cells in which a gene had been successfully silenced. These cells no longer contained Cas9 or any other elements that could trigger an immune response.
They also exchanged the so-called reporter genes. These are genes that are incorporated into the genetic material of the tumour cells in CRISPR screens instead of the silenced genes. Subsequently, the product of these genes enables the researchers to track modified tumour cells in the mice. Instead of the classic reporter genes, which originate from various organisms, a new gene is now used whose product differs only minimally from a protein that is produced naturally in the mice. This allows it to fly under the radar, so to speak, and remain undetected by the immune system.
"We have developed a method for performing CRISPR screens in mice with intact immune systems, without incurring any undesirable side effects," summarises Prof. Aceto. The ingenious thing about this is the fact that the system is versatile and can also be used in humanised mice – animals that have a human immune system. "This is as close to cancer patients as you can get." Moreover, the cloak of invisibility for the gene scissors is also suitable for applications in personalised medicine or for research into autoimmune diseases.
"With this system, we are now achieving a new level of accuracy and – particularly significant for us – we are able to discover new targets for therapies," says Saini.
Overlooked genes for metastasis formation uncovered
The team has already performed a CRISPR screen with the cloaked version of the gene scissors and landed a highly promising hit: silencing two genes called AMH and AMHR2 drastically reduced the number of metastases in a mouse model for breast cancer.
Further investigations showed that the signalling pathway in which these two genes are involved is clinically relevant. For example, the evaluation of patient data revealed that high levels of AMH protein in the tumour are associated with more frequent relapses and higher mortality in breast cancer. Consequently, the AMH/AMHR2 gene pair represents a new approach to combating metastases.
"The significance of this signalling pathway has been underestimated," says Aceto. "Thanks to CRISPR in stealth mode, we are now able to uncover connections that were previously hidden."
Da:
https://www.technologynetworks.com/genomics/news/crispr-gets-an-invisibility-cloak-407241
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