La regolazione di questo gene è essenziale per l'equilibrio del sistema immunitario / Regulating this gene is essential to immune system balance

La regolazione di questo gene è essenziale per l'equilibrio del sistema immunitario / Regulating this gene is essential to immune system balance

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

La messa a punto di un gene coinvolto in modo centrale nella regolazione del sistema immunitario offre potenziali indizi per futuri trattamenti contro l'autoimmunità ed il cancro.

Il sistema immunitario si trova ad affrontare un delicato equilibrio: deve essere sufficientemente aggressivo da combattere infezioni e cancro, ma anche sufficientemente moderato da evitare di attaccare i tessuti del corpo stesso.

Più di due decenni fa, i ricercatori hanno identificato un gene chiamato  FOXP3  che svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento di questo equilibrio e nella prevenzione delle malattie autoimmuni: un lavoro che è valso il premio Nobel per la fisiologia o la medicina di quest'anno.

Ora, gli scienziati del Gladstone Institute (CA, USA) e dell'Università della California a San Francisco (UCSF; CA, USA) hanno mappato l'intricata rete di interruttori genetici che le cellule immunitarie utilizzano per regolare con precisione i livelli di  FOXP3. Le loro scoperte hanno importanti implicazioni per lo sviluppo di terapie immunitarie ed affrontano un mistero di lunga data sul perché questo gene si comporti in modo diverso negli esseri umani rispetto ai topi.

" FOXP3  è assolutamente essenziale per la regolazione del nostro sistema immunitario", ha commentato  Alex Marson, direttore del Gladstone–UCSF Institute of Genomic Immunology, che ha guidato lo studio. "Il modo in cui viene controllato è una questione fondamentale dell'immunologia, ed una risposta dettagliata potrebbe offrire indizi per sviluppare future terapie per le malattie autoimmuni od il cancro".

Una ricerca di interruttori dimmer

Il gene  FOXP3  è attivo in tutti i linfociti T regolatori, che tengono sotto controllo le reazioni immunitarie. Senza questo gene, i linfociti T regolatori non possono funzionare correttamente e il sistema immunitario perde il controllo, attaccando i tessuti dell'organismo. Le persone con mutazioni nel gene FOXP3 sviluppano malattie autoimmuni rare e gravi.

Nei topi,  FOXP3  è attivato solo nei linfociti T regolatori. Ma negli esseri umani, anche i linfociti T convenzionali – le cellule infiammatorie che combattono le infezioni – possono attivare brevemente  FOXP3. Questa differenza ha lasciato perplessi gli immunologi per anni.

Nel nuovo lavoro, il laboratorio di Marson ha utilizzato la tecnologia di silenziamento genico basata su CRISPR per testare sistematicamente 15.000 siti nel DNA che circonda il  gene FOXP3. Cercavano elementi regolatori genetici, ovvero tratti di DNA adiacenti che agiscono come interruttori dimmer, controllando quando e quanto un gene viene attivato o disattivato.

Interrompendo migliaia di posizioni nelle cellule T convenzionali e regolatrici sia umane che murine e misurando poi gli effetti sui  livelli di FOXP3, il gruppo ha identificato quali sequenze di DNA vicine controllano  FOXP3.

"Abbiamo essenzialmente creato una mappa funzionale dell'intero  sistema di controllo FOXP3  ", ha spiegato Jenny Umhoefer, ex ricercatrice post-dottorato nel laboratorio di Marson e prima autrice dell'articolo.

Pannelli di controllo immunitario

Gli esperimenti hanno rivelato che diversi tipi di cellule umane hanno sistemi di controllo diversi per il gene  FOXP3. Nelle cellule T regolatorie, dove  FOXP3  deve rimanere costantemente attivo, più enhancer – sequenze di DNA che aumentano i livelli di un gene – lavorano insieme per garantire che il gene rimanga attivo. Poiché agiscono in modo ridondante, l'interruzione di uno solo di questi enhancer ha avuto solo un effetto limitato sui  livelli di FOXP3.

Nei linfociti T convenzionali, sono stati mappati solo due enhancer. Ma i ricercatori hanno anche scoperto un repressore inaspettato che agisce come un freno sul  gene FOXP3.

"Quello che stiamo osservando è un sofisticato circuito regolatore", ha spiegato Umhoefer. "La cellula ha pedali dell'acceleratore e freni, e li coordina per ottenere un controllo preciso".

Per comprendere non solo dove si trovino questi interruttori genetici, ma anche cosa li controlli, il gruppo ha condotto un secondo screening CRISPR su larga scala. Questa volta, hanno sistematicamente alterato quasi 1350 geni in tutto il genoma per identificare proteine ​​specifiche che controllano  i livelli di FOXP3.

Successivamente, in collaborazione con Ansuman Satpathy, ricercatore affiliato di Gladstone, il gruppo ha utilizzato una tecnica chiamata ChIP-seq per mappare fisicamente la posizione delle proteine ​​sul DNA in relazione al  gene FOXP3.

"Questo è stato un grande passo avanti nello sviluppo di metodi per collegare gli elementi regolatori locali con le proteine ​​che effettivamente si legano a essi", ha commentato Satpathy, che è anche professore associato presso il Dipartimento di Patologia della Stanford School of Medicine. "Nessuno prima d'ora aveva messo insieme questi strumenti in modo così ampio e sistematico".

Un mistero di specie

Il laboratorio di Marson aveva inizialmente ipotizzato che negli esseri umani i linfociti T convenzionali potessero avere un enhancer per attivare  FOXP3, assente nei topi, il che spiega perché le cellule di topo non attivano mai il gene. Sorprendentemente, hanno scoperto che i linfociti T convenzionali nei topi presentano tutti gli stessi elementi enhancer degli esseri umani.

La differenza, hanno capito gli scienziati, potrebbe risiedere nel repressore da loro scoperto. Nei linfociti T convenzionali dei topi, questo repressore mantiene  FOXP3  costantemente disattivato. Quando i ricercatori hanno utilizzato CRISPR per eliminare il repressore dal DNA dei topi, i linfociti T convenzionali hanno iniziato ad esprimere il gene FOXP3 come le cellule umane.

"È stato un risultato sorprendente", ha affermato Marson. "Rimuovendo un singolo elemento repressivo, abbiamo potuto eliminare la differenza di specie e consentire ai linfociti T convenzionali nei topi di esprimere  FOXP3. Questo offre nuovi indizi su come la regolazione dei geni chiave potrebbe evolversi tra le specie".

I risultati evidenziano l'importanza di studiare la regolazione genica nelle cellule umane e sottolineano la necessità di ricercare in modo più ampio i repressori, non solo i più comuni elementi potenziatori.

Ingegneria cellulare di precisione

Il nuovo studio fornisce le basi per gli sforzi continui volti a scoprire e sviluppare nuovi trattamenti per una serie di malattie. Grazie ad una mappa completa dei diversi elementi coinvolti nel controllo dei livelli del  gene FOXP3, i ricercatori possono iniziare a sviluppare nuovi modi per modificare questi livelli per le immunoterapie.

Ad esempio, i trattamenti per le malattie autoimmuni potrebbero trarre beneficio da livelli più elevati di  FOXP3, mentre i trattamenti per il cancro potrebbero funzionare meglio con una minore  attività di FOXP3.

"Al momento sono in corso enormi sforzi per curare le cellule T regolatrici, sia per promuoverne l'attività che per ridurla", ha concluso Marson. "Man mano che comprendiamo nuovi aspetti del circuito che distingue le cellule T regolatrici dalle cellule convenzionali, possiamo pensare a strategie per manipolarlo razionalmente".

ENGLISH

Fine-tuning a gene centrally involved in regulating the immune system offers potential clues for future autoimmunity and cancer treatments.

The immune system faces a delicate balancing act: it must be aggressive enough to fight infections and cancer yet restrained enough to avoid attacking the body’s own tissues.

More than two decades ago, researchers identified a gene called FOXP3 as playing a critical role in maintaining this balance and preventing autoimmune disease – work that garnered this year’s Nobel Prize in Physiology or Medicine.

Now, scientists at Gladstone Institutes (CA, USA) and UC San Francisco (UCSF; CA, USA) have mapped the intricate network of genetic switches that immune cells use to fine-tune levels of FOXP3. Their findings have important implications for developing immune therapies and address a long-standing mystery about why this gene behaves differently in humans than in mice.

“FOXP3 is absolutely essential for regulating our immune systems,” commented Alex Marson, director of the Gladstone–UCSF Institute of Genomic Immunology, who led the study. “How it’s controlled is a fundamental question of immunology, and the detailed answer could offer clues to develop future therapies for autoimmune diseases or cancer.”

A search for dimmer switches

The gene FOXP3 is active in all regulatory T cells, which keep immune reactions in check. Without this gene, regulatory T cells cannot function properly and the immune system spirals out of control, attacking the body’s own tissues. People with mutations in FOXP3 develop rare and severe autoimmune diseases.

In mice, FOXP3 is only switched on in regulatory T cells. But in humans, conventional T cells – the inflammatory cells that fight infections – can also briefly activate FOXP3. This difference has puzzled immunologists for years.

In the new work, Marson’s lab used CRISPR-based gene silencing technology to systematically test 15,000 sites in the DNA surrounding the FOXP3 gene. They were looking for genetic regulatory elements – nearby stretches of DNA that act like dimmer switches, controlling when and how much a gene is turned on or off.

By disrupting thousands of locations in both human and mouse regulatory and conventional T cells and then measuring effects on FOXP3 levels, the team identified which nearby DNA sequences control FOXP3.

“We essentially created a functional map of the entire FOXP3 control system,” explained Jenny Umhoefer, a former postdoctoral fellow in Marson’s lab and first author of the paper.

Immune control panels

The experiments revealed that different human cell types have different control systems for the gene FOXP3. In regulatory T cells, where FOXP3 must remain constantly active, multiple enhancers – DNA sequences that boost the levels of a gene – work together to ensure the gene stays on. Because they work redundantly, disrupting just one of those enhancers had only a small effect on FOXP3 levels.

In conventional T cells, only two enhancers were mapped. But the researchers also discovered an unexpected repressor that acts as a brake on the FOXP3 gene.

“What we’re seeing is a sophisticated regulatory circuit,” Umhoefer shared. “The cell has gas pedals and brakes, and it coordinates them to achieve precise control.”

To understand not just where these genetic switches are located, but also what controls them, the team conducted a second massive CRISPR screen. This time, they systematically disrupted nearly 1350 genes throughout the genome to identify specific proteins that control FOXP3 levels.

Then, working with Gladstone Affiliate Investigator Ansuman Satpathy, the team used a technique called ChIP-seq to physically map where the proteins are located on the DNA in relation to the FOXP3 gene.

“This was a big step forward in developing ways to link the local regulatory elements with the proteins that actually bind to them,” commented Satpathy, who is also an associate professor in the Department of Pathology at the Stanford School of Medicine. “No one had put together these tools in such a broad, systematic way before.”

A species mystery

Marson’s lab had initially hypothesized that in humans, conventional T cells may have an enhancer to turn on FOXP3 that is missing in mice, explaining why the mouse cells never flip the gene on. Surprisingly, they found that conventional T cells in mice have all the same enhancer elements as humans.

The difference, the scientists realized, may lie in the repressor they discovered. In mouse conventional T cells, this repressor keeps FOXP3 constantly off. When the researchers used CRISPR to delete the repressor from mice DNA, the conventional T cells began to express the FOXP3 gene like human cells.

“This was a striking result,” Marson shared. “By removing a single repressive element, we could break the species difference and enable conventional T cells in mice to express FOXP3. This offers new hints as to how regulation of key genes might evolve across species.”

The findings point to the importance of studying gene regulation in human cells and underscore the need to look broadly for repressors – not just the more common enhancer elements.

Precision cell engineering

The new study provides a foundation for ongoing efforts to discover and develop new treatments for a range of diseases. Armed with a full map of the different elements involved in controlling the levels of the FOXP3 gene, researchers can begin to develop new ways of tweaking these levels for immunotherapies.

Treatments for autoimmune diseases, for instance, may benefit from increased levels of FOXP3, while treatments for cancer may work better with lower FOXP3 activity.

“There are enormous efforts right now to drug regulatory T cells, either to promote their activity or reduce it,” Marson concluded. “As we understand new aspects of the circuitry that distinguishes regulatory T cells from conventional cells, we can think about strategies to rationally manipulate it.”

Da:

https://www.biotechniques.com/crispr/regulating-a-gene-central-to-the-immune-system/?utm_campaign=BioTechniques%20-%20Weekly%20NL&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz-9yg_Tn9VHzPsHo1xVgk1AybdsWTuUHA9YY_I4UEAYLvns5ryKuT3fUfvl1pP3_9puocjPy07JJUziT2hgi1n-yZySBD1UvlbELdfnyr08xcBrlUGw&_hsmi=391262419&utm_content=391072179&utm_source=hs_email