L'alba delle terapie di editing genetico indipendenti dalle malattie / The Dawn of Disease-Agnostic Gene Editing Therapies
L'alba delle terapie di editing genetico indipendenti dalle malattie / The Dawn of Disease-Agnostic Gene Editing Therapies
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
"Concluderò con un'idea un po' folle e folle, ma credo che in realtà abbia un reale potenziale per il bene dei pazienti."
La sala è rimasta sbalordita quando David Liu, PhD, l'inventore della tastiera genomica basata sull'editing di base e sull'editing di prime, ha pronunciato queste parole a due terzi del suo intervento di febbraio alla Precision Medicine World Conference (PMWC) 2025 nella Silicon Valley. L'intero pubblico, compresi quelli al telefono, si è concentrato sull'oratore e sullo schermo, in un'immobilità anticipata, finché Liu non ha rivelato che il suo laboratorio stava sviluppando terapie di editing genetico singolo per curare molteplici malattie genetiche non correlate, indipendentemente dal gene o dal tessuto.
Solo mesi dopo, quando Liu si è unito a me nel podcast Behind the Breakthroughs, ho avuto un'altra anticipazione. Nell'episodio, Liu ha spiegato che "una composizione di materia, una siringa di roba" – un agente di editing primario più un pegRNA – potrebbe curare in modo permanente più pazienti con malattie genetiche non correlate. Ha accennato ai risultati entusiasmanti del suo laboratorio, la cui pubblicazione è prevista per la fine dell'anno. Questo mi ha lasciato in attesa del prossimo indizio, che finalmente si è materializzato questa settimana.
L'idea "folle e folle" a cui si riferiva Liu si chiama prime editing-mediated readthrough of premature termination codons (PERT), una strategia per salvare mutazioni nonsenso in modo "indipendente dalla malattia". PERT utilizza una singola composizione di prime editing per convertire permanentemente un tRNA endogeno "eliminabile" in un tRNA soppressore ottimizzato (sup-tRNA) che legge un codone di stop prematuro.
L'articolo pubblicato su Nature dimostra che la semplice modifica di un elemento costitutivo del DNA per creare un tRNA soppressore permanente, anziché riparare un gene difettoso, potrebbe potenzialmente contribuire a trattare molti disturbi da codoni di stop. I codoni di stop prematuri, che causano proteine troncate, si verificano in circa il 10-15% delle varianti patogene e contribuiscono a quasi un terzo dei disturbi mendeliani noti.
"Una volta sviluppato ed ottimizzato un prime editor in grado di installare un tRNA in grado di recuperare un certo tipo di codone di stop prematuro, si potrebbe essere in grado di applicare lo stesso prime editor a molti diversi codoni di stop prematuri nello stesso gene od in altri geni", ha dichiarato Liu a Inside Precision Medicine questa settimana. "Questa strategia potrebbe ridurre drasticamente i tempi ed i costi di sviluppo di trattamenti per pazienti le cui mutazioni individuali sono troppo rare per giustificare programmi su misura. La somministrazione dovrà comunque essere personalizzata per ciascun tessuto – l'occhio, il muscolo, il fegato od il sangue – ma l'editor stesso potrebbe rimanere lo stesso. L'editing può essere sviluppato in un modo che non sia solo agnostico rispetto alla mutazione ma, per certi aspetti, anche rispetto alla malattia".
Mentre il settore guarda oltre le terapie a singola mutazione, verso piattaforme che potrebbero aiutare popolazioni di pazienti molto più ampie, i ricercatori notano una convergenza di interessi tra scienza, industria e regolamentazione. "Gli interessi di tutti ed il modo in cui vediamo ciò che è necessario per il futuro affinché la promessa dei trattamenti di editing genetico possa beneficiare il maggior numero possibile di pazienti che ne hanno urgente bisogno, puntano tutti nella stessa direzione", ha affermato Liu.
La terapia delle mutazioni senza senso ripensata
Le strategie terapeutiche per le mutazioni nonsenso includono farmaci readthrough a piccole molecole, terapia genica e tRNA soppressori ingegnerizzati, ognuno con vantaggi e limiti distinti. I farmaci readthrough sono i più semplici – inducono i ribosomi ad ignorare gli arresti prematuri – ma offrono un modesto recupero proteico, richiedono un dosaggio a vita ed agiscono in modo incoerente. La terapia genica, in genere tramite virus adeno-associati (AAV), fornisce un nuovo gene ma è gene-specifico, limitato dalle dimensioni del vettore e influenzato dalla durata e dalle barriere immunitarie. I tRNA soppressori ingegnerizzati, come quelli sviluppati da Alltrna, sono più indipendenti dal gene e dalla malattia, ma in quanto macromolecole affrontano sfide in termini di potenza, specificità e dosaggio.
Dan Wang, PhD, professore associato presso la UMass Chan Medical School, il cui laboratorio lavora sulla terapia genica AAV e ha precedentemente sviluppato agenti readthrough a piccole molecole, ha spiegato che, sebbene questi farmaci possano, in linea di principio, raggiungere tutto il corpo, presentano notevoli svantaggi, soprattutto nei disturbi multisistemici come la sindrome di Hurler (MPS I), causata da una mutazione non senso nell'IDUA che porta ad un accumulo diffuso di glicosaminoglicani.
Poiché i farmaci readthrough efficaci richiedono dosaggi elevati, Wang ha descritto "un dilemma: si vuole raggiungere quante più parti del corpo possibile, ma in altri casi si vuole colpire specificamente il punto che si desidera colpire". La sensibilità dei tessuti complica ulteriormente la situazione: i neuroni potrebbero essere più sensibili alla tossicità globale del readthrough, afferma Wang. Per le malattie che colpiscono i muscoli od il fegato, "non si vuole che il farmaco raggiunga il maggior numero di zone possibile, ma si vuole colpire i tessuti che contano davvero".
Wang ha osservato che tutti questi approcci condividono un problema di sicurezza comune: gli effetti off-target sui normali codoni di stop. "Questo problema deve ancora essere studiato su animali di dimensioni maggiori e su intervalli di tempo più lunghi per valutare appieno il profilo di sicurezza degli agenti read-through, che si tratti di piccole molecole o di altre modalità". Esistono alcuni studi di questo tipo – ha letto almeno un abstract di una conferenza – ma la ricerca è in corso.
Il gruppo di Liu al Broad Institute ha affrontato le mutazioni nonsenso utilizzando il prime editing per convertire i geni tRNA ridondanti in sup-tRNA. Gli esseri umani hanno 418 geni tRNA ad alta confidenza, ma necessitano solo di 61 codoni, lasciandone molti superflui. Le prove dimostrano che le persone con delezioni o mutazioni che alterano l'anticodone in alcuni tRNA rimangono sane e sistemi cellulari come i segnali di terminazione ridondanti ed il decadimento continuo proteggono dagli errori.
I dottorandi Sarah Pierce, PhD, e Steven Erwood, PhD, hanno convertito sistematicamente tutti i 418 geni tRNA umani in potenziali soppressori. Le prime versioni erano deboli: una copia endogena produceva solitamente un read-through debole, innescando librerie di varianti di anticodone, leader, terminatori e modifiche delle coppie di basi. Questo ha prodotto tRNA "super-soppressori" che producevano proteine a lunghezza intera circa cinque volte superiori rispetto ai modelli con solo anticodone. Supp-tRNA ottimizzati specifici per la leucina, insieme a scheletri di arginina, tirosina e serina, hanno ripristinato fino al 35% della GFP normale nei test reporter.
Il prime editing ha installato questi soppressori nei loci endogeni con un'efficienza del 70-80%. Un singolo editor ha ripristinato tre mutazioni nonsenso in modelli di linee cellulari umane di malattie genetiche non correlate – malattia di Batten, malattia di Tay-Sachs e fibrosi cistica – ripristinando il 20-70% dei normali livelli di enzimi o proteine. In vivo, un topo reporter GFP ha mostrato il 10-20% di editing e circa il 25% di GFP normale negli emisferi cerebrali. In un modello di sindrome di Hurler, lo stesso editor somministrato tramite AAV ha ripristinato il 5-7% della normale attività enzimatica in più tessuti – oltre l'1% circa necessario per il ripristino completo – ed i topi trattati hanno mostrato una correzione quasi completa dei sintomi.
Il problema del fuori bersaglio (ed altre preoccupazioni sulla sicurezza)
Il gruppo di Liu ha anche testato se il loro approccio potesse inavvertitamente alterare le cellule. Una preoccupazione riguardava l'editing off-target. Come altri hanno riportato, il prime editing produce generalmente un'attività off-target molto bassa perché il suo meccanismo multi-step crea molteplici checkpoint che rifiutano le corrispondenze errate. Utilizzando due test complementari di rilevamento a livello genomico – metodi sviluppati appositamente dai ricercatori per essere insolitamente completi – non hanno trovato modifiche off-target rilevabili sostituendo il tRNA endogeno con il tRNA ottimizzato per il soppressore di TAG.
Un altro potenziale rischio era la lettura involontaria dei codoni di stop naturali. Oltre 4.000 geni umani terminano con un codone di terminazione TAG e bypassare questi stop potrebbe generare proteine aberranti. Per cercare prove, il gruppo di Liu ha calcolato i peptidi esatti che verrebbero prodotti se la traduzione superasse il TAG naturale ed arrivasse al 3' UTR, quindi li ha ricercati utilizzando la spettrometria di massa mirata. Come controllo positivo, hanno confermato abbondanti peptidi di lettura dal reporter GFP ingegnerizzato. Tuttavia, Liu è rimasto sorpreso dal fatto che il suo gruppo non abbia trovato alcun peptide corrispondente a letture in corrispondenza dei codoni di stop TAG nativi. L'unico gene che ha prodotto un segnale debole è stato YARS, che codifica per la tirosil-tRNA sintetasi, ma le quantità erano così basse da non essere considerate statisticamente significative.
"Con mia sorpresa, non abbiamo osservato un singolo peptide corrispondente alla lettura del codone di terminazione naturale nelle sequenze codificanti per proteine che terminano naturalmente con codoni di stop tag", ha affermato Liu. "Abbiamo osservato un segnale che potrebbe essere un segnale reale ad un livello molto basso, ma era statisticamente significativo rispetto al controllo non trattato".
Infine, i ricercatori hanno misurato i livelli globali di RNA e proteine, un metodo sensibile per individuare stress cellulare od altre perturbazioni indesiderate. Liu ha spiegato che cambiamenti drastici nella stechiometria dei componenti della traduzione – ovvero improvvisi aumenti delle concentrazioni di un tRNA di un fattore 10, 100 o 1.000, o grandi variazioni nella concentrazione di amminoacidi – possono perturbare la traduzione a livello globale.
"Modificare la stechiometria dei componenti della traduzione può accelerare o rallentare la traduzione per diversi trascritti. Si può persino causare l'erosione del controllo di qualità, ovvero l'accuratezza della traduzione", ha affermato Liu. "Questo fenomeno è noto da decenni. Se si inonda una cellula con un tipo di tRNA, si possono osservare più errori nell'inserimento del suo amminoacido da parte di quel tRNA, anche se il codone non corrisponde perfettamente all'anticodone di quel tRNA. Perché la traduzione, come molti processi complessi in biologia, è in realtà una competizione tra decine di molecole diverse".
Contrariamente alle previsioni di Liu, il gruppo di ricerca non ha riscontrato trascrizioni o proteine che cambiassero di più del doppio tra le cellule trattate e quelle non trattate, una soglia comune per effetti biologici significativi.
Nel complesso, l'assenza di modifiche off-target rilevabili, di read-through del codone di stop o di variazioni nel trascrittoma e nel proteoma suggerisce che il sistema lasci lo stato naturale della cellula sostanzialmente inalterato. Tuttavia, i ricercatori hanno sottolineato che i risultati negativi sono limitati dalla sensibilità dei metodi utilizzati. Da scienziato provetto qual è, Liu ha affermato: "Tutti i risultati negativi devono essere considerati attraverso la lente del metodo utilizzato per rilevarli. Sebbene abbiamo fatto del nostro meglio per utilizzare metodi all'avanguardia per rilevare ciascuno di questi tipi di potenziali conseguenze indesiderate, tutto ciò che possiamo dire è che i metodi che utilizziamo non hanno portato alla rilevazione di modifiche off-target od alla traduzione oltre i codoni di terminazione naturali, né a cambiamenti nel trascrittoma e nel proteoma".
Oltre le malattie del codone di stop
Erwood ha spiegato che il gruppo di Broad ha scelto di convertire un tRNA endogeno in un soppressore per mantenere il sistema "il meno dirompente possibile" e mantenere la regolazione nativa. "In questa prima dimostrazione, abbiamo adottato un approccio relativamente semplice: abbiamo utilizzato il prime editing per riscrivere un gene tRNA endogeno in un sup-tRNA", ha dichiarato Erwood a Inside Precision Medicine .
"Questo ha funzionato bene per il locus del tRNA della leucina da noi scelto, che era 'riutilizzabile' in tutta sicurezza. Ma non sarà sempre così... immaginate di identificare un tRNA soppressore dell'arginina molto potente, ma il gene endogeno del tRNA dell'arginina che lo codifica non può essere riscritto in modo sicuro senza interrompere la normale traduzione."
Anche l'efficienza di editing, la distribuzione ed il contesto dello specifico codone di stop prematuro saranno importanti. "Alcuni contesti sono più facili da sopprimere di altri, come abbiamo già visto quando abbiamo testato PERT su una manciata e poi su migliaia di codoni di stop prematuri", ha affermato Liu. "In seguito, stiamo espandendo PERT ampliando la portata del codone di terminazione e l'amminoacido che può essere installato".
Liu spera di costruire un kit di strumenti in grado di gestire tutte le varianti di mutazione nonsenso. "Vorremmo assemblare... un piccolo set di agenti PERT per ogni codone di stop, in modo da poter scegliere tra diversi tipi di amminoacidi... magari uno idrofobico, uno con carica positiva, uno con carica negativa ed uno polare", ha detto. "Se si disponesse di una dozzina di questi tipi di amminoacidi, ci sarebbero probabilità ragionevolmente alte di poter recuperare funzionalmente praticamente qualsiasi codone di stop prematuro".
Parlando con Inside Precision Medicine, Pierce ha osservato che le strutture portanti identificate finora potrebbero "correggere oltre il 30% di tutte le mutazioni nonsenso documentate con l'installazione precisa dell'amminoacido originale". Poiché "solo 19 cambiamenti di singoli nucleotidi portano ad una mutazione nonsenso", ha aggiunto, "dovremmo solo ottimizzare 19 diverse strutture portanti di sup-tRNA... per la correzione precisa di tutte le mutazioni nonsenso con PERT".
In linea di principio, il tRNA soppressore potrebbe anche essere trasportato da una cassetta promotore-terminatore appositamente progettata, inserita in un porto sicuro genomico utilizzando twin-PE, PASSIGE o EvoCAST. "Strumenti come twinPE o eePASSIGE consentirebbero di installare una nuova cassetta tRNA soppressore in altre parti del genoma, preservando l'espressione del gene originale del tRNA dell'arginina", ha affermato Erwood. Questo approccio consentirebbe anche l'inclusione di varianti che migliorano la soppressione, non realizzabili riscrivendo direttamente un tRNA endogeno.
"In teoria, si potrebbe ottenere il PERT senza convertire un tRNA endogeno e superfluo... semplicemente aggiungendo il soppressore ingegnerizzato al genoma", ha detto Liu. "Personalmente, penso che sia particolarmente elegante convertire uno dei 418 geni del tRNA... perché sembra meno perturbativo... che aggiungere qualcosa in una cellula e non sapere se il posto aggiunto verrà cromatinizzato o regolato in un modo imprevisto."
Pierce ha aggiunto che per le famiglie di tRNA con elevata similarità di sequenza, l'installazione del soppressore altrove "ci consentirebbe di installare in modo sicuro quel sup-tRNA senza dover prendere di mira un'intera famiglia di geni tRNA contemporaneamente".
Liu sta anche valutando come queste intuizioni possano essere applicate ad altri difetti molecolari condivisi. "Stiamo anche cercando di estendere lo stesso approccio ad altri tipi di anomalie comuni del flusso di informazioni", ha affermato. "Ad esempio, diverse malattie sono causate da un ripiegamento od una localizzazione anomala delle proteine". Molte malattie genetiche convergono su questi percorsi condivisi, rendendole bersagli interessanti per terapie ampiamente applicabili.
Accelerare l'approvazione normativa
Nonostante la loro promessa, i sup-tRNA devono affrontare ostacoli importanti. Garantire la sicurezza alterando al contempo i meccanismi fondamentali della traduzione o dell'elaborazione dell'RNA non è un compito banale, poiché interventi ad ampio raggio rischiano di avere conseguenze indesiderate fuori bersaglio. La somministrazione rimane un'altra sfida: una terapia veramente agnostica nei confronti dei geni deve essere efficace in più tessuti, alcuni dei quali difficili da raggiungere.
Liu cita "Baby KJ", il cui caso ha segnato il primo utilizzo clinico dell'editing di basi CRISPR. Una delle due mutazioni patogene che ha ereditato era un codone di stop TAG, esattamente il tipo che PERT è progettato per bypassare. "Esistono molti altri codoni di stop TAG prematuri nelle malattie epatiche che causano malattie gravi", ha osservato Liu. In tali contesti, dove tecnologie di somministrazione come AAV o LNP sono già clinicamente validate, "non è necessario inventare nuovi metodi scientifici, di somministrazione o di produzione" per iniziare ad adattare tali sistemi a PERT, una volta completato il lavoro preclinico sulla sicurezza. "Non intendo dire che si dovrebbe somministrare PERT ad un paziente domani", ha aggiunto, "ma... potrebbe non essere necessario inventare molto altro".
I progressi in un singolo tessuto spesso accelerano i progressi a tutto campo. Il successo del trattamento di KJ, ha affermato Liu, "ha un impatto sinergico", riducendo i rischi di futuri studi di editing nel fegato e oltre. La stessa dinamica potrebbe verificarsi con gli agenti di editing basati su AAV, che si basano su decenni di esperienza nella terapia genica basata su AAV. E con ogni nuova frontiera superata, il clima degli investimenti cambia. "I primi successi apriranno nuove opportunità", ha affermato Liu, "ulteriori sistemi di organi potrebbero diventare bersagli validi per la prossima ondata di terapie programmabili".
I percorsi regolatori per le terapie che mirano ad un meccanismo piuttosto che ad una malattia sono ancora in fase di evoluzione. Se avranno successo, le terapie gene-agnostiche potrebbero semplificare notevolmente il panorama terapeutico, consentendo ad un'unica composizione di materia di trattare decine di malattie rare contemporaneamente. Per i pazienti affetti da patologie ultra-rare o scarsamente trattate, questo cambiamento potrebbe rivelarsi trasformativo, offrendo un percorso terapeutico che non richiede lo sviluppo di farmaci personalizzati per ogni singola mutazione.
Immobili di pregio
Quando Liu ha proposto l'idea per la prima volta, nove mesi fa, ho immaginato che sarebbe stata qualcosa di un'altra dimensione. Non è stato così, poiché l'idea di colpire i codoni di stop prematuri creati da mutazioni senza senso risale a decenni fa. Sebbene non si trattasse di una novità assoluta, non esiste ancora un prodotto commerciale clinicamente approvato per le malattie da codoni di stop, che sono notevolmente diffuse. Negli Stati Uniti, circa 8.000 persone con fibrosi cistica, 252.000 con malattia di Stargardt, 31.000 con fenilchetonuria (PKU) e 43.500 con distrofia muscolare di Duchenne presentano specifiche alterazioni genetiche che potrebbero essere potenzialmente trattate con terapie volte a correggere questo tipo di mutazioni.
"A mia conoscenza, questo sembra essere l'unico approccio di terapia genica disponibile che sia indipendente dalla malattia", ha affermato Wang. "In genere, adottiamo un approccio basato su una malattia ed una terapia. Per un gene difettoso, dobbiamo fornire quel gene per curare quella particolare malattia; questo è tutto. E per l'editing genetico, è ancora più specifico; in molti casi è specifico per un allele od una mutazione".
La questione più importante ora è come una piattaforma del genere possa passare dal laboratorio alla clinica e chi la guiderà in questo percorso. PERT è ancora una scienza in fase iniziale, ma la sua architettura si allinea naturalmente allo sviluppo commerciale. Una terapia indipendente dalla malattia e dal gene che utilizza lo stesso editor e sostituisce solo il pegRNA o il backbone soppressore assomiglia ad una vera e propria tecnologia di piattaforma, che potrebbe ammortizzare i costi di sviluppo per decine di indicazioni. Se l'editor stesso non cambia, gran parte del lavoro di sicurezza, distribuzione e produzione potrebbe, in linea di principio, essere riutilizzato, abbassando le barriere per le malattie ultra-rare che attualmente non hanno alcuna giustificazione di mercato.
Se PERT rientri o meno sotto l'egida di Prime Medicine, l'azienda co-fondata da Liu per tradurre le tecnologie di prime editing, rimane una questione aperta. Il panorama della proprietà intellettuale che circonda il prime editing è già strettamente interconnesso tra Harvard, il Broad Institute e Prime Medicine, e qualsiasi terapia basata sui componenti principali del prime editing si intreccerebbe quasi certamente con tale patrimonio.
Tuttavia, che PERT diventi un programma di Medicina di Prima Generazione od una nuova iniziativa, le implicazioni più ampie rimangono le stesse: un'unica composizione di materia che potrebbe fungere da spina dorsale per decine di terapie per malattie rare segnerebbe un cambiamento fondamentale nel modo in cui i farmaci genetici vengono sviluppati, regolamentati e commercializzati. Per i pazienti le cui mutazioni sono state a lungo troppo rare per interessare l'industria, una piattaforma come PERT potrebbe finalmente renderle visibili, non una mutazione alla volta, ma tutte in una volta.
ENGLISH
The lab of “genetic surgery” pioneer David Liu, PhD, uses prime editing to build a platform for targeting nonsense mutations driving stop codon diseases.
“I’ll end with a little bit of a wild, crazy idea, but I think it’s actually one that has the real potential for the benefit of patients.”
The room was stunned when David Liu, PhD, the inventor of the genomic keyboard from base editing and prime editing, said this two-thirds of the way through his February talk at the Precision Medicine World Conference (PMWC) 2025 in Silicon Valley. The entire audience, including those on their phones, became laser-focused on the speaker and screen, in an anticipatory freeze, until Liu revealed that his lab was developing single gene-editing therapies to treat multiple, unrelated genetic diseases regardless of gene or tissue.
It wasn’t until months later when Liu joined me on the Behind the Breakthroughs podcast that I got another sneak peek. In the episode, Liu explained that “one composition of matter, one syringe of stuff”—one prime editing agent plus one pegRNA—could permanently treat multiple patients with unrelated genetic diseases. He teased that his lab had exciting results with a publication due later in the year. That left me waiting for the next clue, which finally materialized this week.
The “wild, crazy idea” Liu was referring to is called prime editing-mediated readthrough of premature termination codons (PERT), a strategy to rescue nonsense mutations in a “disease-agnostic” manner. PERT uses a single prime editing composition to permanently convert a “dispensable” endogenous tRNA into an optimized suppressor tRNA (sup-tRNA) that reads through a premature stop codon.
The article published in Nature shows that simply changing one building block of DNA to create a permanent suppressor tRNA, instead of fixing a faulty gene, could potentially help treat many stop codon disorders. Premature stop codons—which result in truncated proteins—occur in roughly 10–15% of pathogenic variants and contribute to nearly a third of known Mendelian disorders.
“Once you’ve developed and optimized one prime editor that can install a tRNA that can rescue a certain type of premature stop codon, you may be able to apply that same prime editor to many different premature stop codons in the same gene or in other genes,” Liu told Inside Precision Medicine this week. “This strategy could dramatically reduce the time and cost of developing treatments for patients whose individual mutations are too rare to justify bespoke programs. Delivery will still need to be tailored to each tissue—the eye versus the muscle versus the liver versus the blood—but the editor itself could remain the same. The editing can be developed in a way that’s not just mutation agnostic but, in some respects, also disease agnostic.”
As the field looks beyond single-mutation therapies toward platforms that could help far larger patient populations, researchers see a convergence of interests across science, industry, and regulation. “Everyone’s interests and the way we see what’s needed for the future to get the promise of gene editing treatments to benefit as many patients who urgently need these treatments as possible are all pointing in the same direction,” Liu said.
Nonsense mutation therapeutics reimagined
Therapeutic strategies for nonsense mutations include small-molecule readthrough drugs, gene therapy, and engineered suppressor tRNAs, each with distinct advantages and limitations. Readthrough drugs are simplest—coaxing ribosomes to ignore premature stops—but offer modest protein rescue, require lifelong dosing, and act inconsistently. Gene therapy, typically via adeno-associated viruses (AAVs), supplies a new gene but is gene-specific, limited by vector size, and affected by durability and immune barriers. Engineered suppressor tRNAs, such as those developed by Alltrna, are more gene- and disease-agnostic, yet as macromolecules they face challenges in potency, specificity, and dosing.
Dan Wang, PhD, assistant professor at UMass Chan Medical School, whose lab works on AAV gene therapy and previously developed small-molecule readthrough agents, explained that while these drugs can, in principle, reach the whole body, they have major drawbacks—especially in multisystem disorders like Hurler syndrome (MPS I), caused by a nonsense mutation in IDUA that leads to widespread glycosaminoglycan accumulation.
Because effective readthrough drugs require high dosing, Wang described “a dilemma—you want to reach as many body parts as possible, but in other cases you want to specifically target the place you want to target.” Tissue sensitivity complicates this further: neurons may be more sensitive to global readthrough toxicity, Wang says. For muscle- or liver-focused diseases, “you do not want your agent to go as many places as possible—you want to target the tissues that really matter.”
Wang noted that all these approaches share a common safety concern: off-target effects on normal stop codons. “This issue still needs to be studied in larger animals and over longer time frames to fully assess the safety profile of read-through agents, whether small molecules or other modalities.” A few such studies exist—he has seen at least one conference abstract—but research is ongoing.
Liu’s team at the Broad Institute tackled nonsense mutations using prime editing to convert redundant tRNA genes into sup-tRNAs. Humans have 418 high-confidence tRNA genes but only need 61 codons, leaving many dispensable. Evidence shows people with deletions or anticodon-altering mutations in certain tRNAs remain healthy, and cellular systems like redundant termination signals and nonstop decay protect against errors.
Postdocs Sarah Pierce, PhD, and Steven Erwood, PhD, systematically converted all 418 human tRNA genes into candidate suppressors. Early versions were weak: one endogenous copy usually produced weak read-through, prompting libraries of anticodon variants, leaders, terminators, and base-pair modifications. This yielded “super-suppressor” tRNAs producing full-length proteins roughly fivefold higher than anticodon-only designs. Optimized leucine-specific sup-tRNAs, plus arginine, tyrosine, and serine backbones, restored up to 35% of normal GFP in reporter assays.
Prime editing installed these suppressors at endogenous loci with 70–80% efficiency. A single editor rescued three nonsense mutations in human cell line models of unrelated genetic disorders—Batten disease, Tay–Sachs disease, and cystic fibrosis—restoring 20–70% of normal enzyme or protein levels. In vivo, a GFP reporter mouse showed 10–20% editing and ~25% normal GFP across brain hemispheres. In a Hurler syndrome model, the same editor delivered by AAV restored 5–7% of normal enzyme activity across multiple tissues—above the ~1% needed for full rescue—and treated mice showed near-complete correction of symptoms.
The off-target problem (and other safety concerns)
Liu’s team also tested whether their approach might inadvertently disrupt cells. One concern was off-target editing. As others have reported, prime editing generally yields very low off-target activity because its multi-step mechanism creates multiple checkpoints that reject incorrect matches. Using two complementary, genome-wide detection assays—methods the researchers developed specifically to be unusually comprehensive—they found no detectable off-target edits when replacing the endogenous tRNA with the optimized TAG-suppressor tRNA.
Another potential risk was unintended read-through of natural stop codons. More than 4,000 human genes end with a TAG termination codon, and bypassing those stops could generate aberrant proteins. To seek evidence, Liu’s team calculated the exact peptides that would be produced if translation ran past the natural TAG and into the 3′ UTR, then searched for them using targeted mass spectrometry. As a positive control, they confirmed abundant read-through peptides from the engineered GFP reporter. However, Liu was surprised that his team did not find any peptides that corresponded to read-throughs at native TAG stop codons. The only gene that produced a faint signal was YARS, which encodes tyrosyl-tRNA synthetase, but the amounts were so low that they were not deemed statistically significant.
“Somewhat to my surprise, we did not observe a single peptide corresponding to readthrough of the natural termination codon at protein-coding sequences that are naturally terminated with tag stop codons,” said Liu. “We observed one signal that might be a real signal at a very low level, but it was statistically significant compared to the untreated control.”
Finally, the researchers measured global RNA and protein levels, a sensitive way to spot cellular stress or other unintended perturbations. Liu explained dramatic changes in the stoichiometry of the components of translation—that is, sudden increases in the concentrations of a tRNA by a factor of 10, 100, or 1,000, or changes in the concentration of amino acids by large amounts—can globally perturb translation.
“Changing the stoichiometry of the components of translation can cause translation to speed up or slow down for different transcripts. You can even cause the quality control, that is, the accuracy of translation, to get eroded,” said Liu. “This phenomenon has been known for decades. If you flood a cell with one type of tRNA, you can observe more mistakes in which that tRNA inserts its amino acid, even if the codon isn’t a perfect match for the anticodon of that tRNA. Because translation, like many complicated processes in biology, is really a competition between dozens of different molecules.”
Contrary to Liu’s predictions, the research team saw no transcripts or proteins that changed by more than twofold between treated and untreated cells, a common threshold for meaningful biological effects.
Taken together—the absence of detectable off-target edits, stop-codon read-through, or shifts in the transcriptome and proteome—suggests the system leaves the cell’s natural state largely undisturbed. Still, the researchers emphasized that negative results are limited by the sensitivity of the methods used. Consummate scientist that he is, Liu said, “All negative results have to be viewed through the lens of the method used to detect them. While we did our best to use state-of-the-art methods to detect each of those kinds of potential unwanted consequences, all we can say is that the methods we use did not lead to detected off-target edits or translation past natural termination codons or changes in the transcriptome and proteome.”
Beyond stop codon diseases
Erwood explained that the Broad team chose to convert an endogenous tRNA into a suppressor to keep the system “as minimally disruptive as possible” and to maintain native regulation. “In this first demonstration, we took a relatively simple approach: we used prime editing to rewrite an endogenous tRNA gene into a sup-tRNA,” Erwood told Inside Precision Medicine.
“That worked well for our chosen leucine tRNA locus, which was safely ‘repurposeable.’ But that won’t always be the case… imagine you identify a very potent arginine suppressor tRNA, but the endogenous arginine tRNA gene that encodes it can’t be safely rewritten without disrupting normal translation.”
Editing efficiency, delivery, and the context of the specific premature stop codon will also matter. “Some contexts are easier to suppress than others, as we’ve already seen when we tested PERT against a handful and then thousands of premature stop codons,” said Liu. “Next, we’re expanding PERT by expanding the scope of the termination codon and the amino acid that can be installed.”
Liu hopes to build a toolkit that can handle all variations of nonsense mutation. “We would like to assemble… a small set of PERT agents for each stop codon so that you have the choice of a few different flavors of amino acid… maybe a hydrophobic one, a positively charged one, a negatively charged one, and a polar one,” he said. “If you had a dozen such flavors, there would be a reasonably high chance of being able to functionally rescue just about any premature stop codon.”
In speaking with Inside Precision Medicine, Pierce noted that the backbones identified so far could “correct >30% of all documented nonsense mutations with precise installation of the original amino acid.” Because “only 19 single nucleotide changes lead to a nonsense mutation,” she added, “we would only need to optimize 19 different sup-tRNA backbones… for precise correction of all nonsense mutations with PERT.”
In principle, the suppressor tRNA could also be delivered from a designed promoter–terminator cassette inserted into a genomic safe harbor using twin-PE, PASSIGE, or EvoCAST. “Tools like twinPE or eePASSIGE would let you install a new suppressor tRNA cassette elsewhere in the genome while preserving expression of the original arginine tRNA gene,” Erwood said. This approach would also allow inclusion of suppression-enhancing variants not feasible when rewriting an endogenous tRNA directly.
“In theory, you could achieve PERT without converting an endogenous, dispensable tRNA… just by adding the engineered suppressor to the genome,” Liu said. “personally, I think it’s particularly elegant to convert one of the 418 tRNA genes… because it seems less perturbative… than adding something into a cell and not knowing if the place that you added is going to get chromatinized or regulated in a way that you didn’t anticipate.”
Pierce added that for tRNA families with high sequence similarity, installing the suppressor elsewhere “would allow us to safely install that sup-tRNA without targeting an entire family of tRNA genes at once.”
Liu is also considering how these insights might apply to other shared molecular defects. “We’re also trying to expand the same approach to cover other types of common information-flow abnormalities,” he said. “For example, quite a few diseases are caused by misfolding or mislocalization of proteins.” Many genetic disorders converge on such shared pathways, making them attractive targets for broadly applicable therapies.
Speeding up regulatory approval
Despite their promise, sup-tRNAs face major hurdles. Ensuring safety while altering fundamental translational or RNA-processing machinery is nontrivial, as broad-acting interventions risk unintended off-target consequences. Delivery remains another challenge: a truly gene-agnostic therapy must work in multiple tissues, some of which are difficult to reach.
Liu points to “Baby KJ,” whose case marked the first clinical use of CRISPR base editing. One of the two disease-causing mutations he inherited was a TAG stop codon—exactly the type PERT is designed to bypass. “There are lots of other premature TAG stop codons in liver diseases that cause serious disease,” Liu noted. In such settings, where delivery technologies like AAV or LNPs are already clinically validated, “you don’t need to invent any new science or delivery or manufacturing methods” to begin adapting those systems for PERT, once preclinical safety work is complete. “I don’t mean to imply that you should go put PERT into a patient tomorrow,” he added, “but… you may not need to invent much else.”
Progress in one tissue often accelerates progress across the board. The success of KJ’s treatment, Liu said, “has a synergistic impact,” de-risking future editing trials in the liver and beyond. The same dynamic may unfold with AAV-delivered editing agents, which build on decades of AAV-delivered gene-therapy experience. And with each new frontier crossed, the investment climate shifts. “the first successes will open up new opportunities,” Liu said, “additional organ systems could become viable targets for the next wave of programmable therapeutics.”
Regulatory pathways are still evolving for therapeutics that target a mechanism rather than a disease. If successful, gene-agnostic therapeutics could dramatically streamline the treatment landscape—allowing one composition of matter to address dozens of rare diseases at once. For patients with ultra-rare or underserved conditions, this shift could be transformative, offering a route to therapy that does not require bespoke drug development for each individual mutation.
Prime real estate
When Liu first teased the idea nine months ago, I imagined it was going to be something from another dimension. That didn’t end up being the case, as the idea of targeting premature stop codons created by nonsense mutations is decades old. Although absolute novelty was not the case, there has yet to be a clinically approved commercial product targeting stop codon diseases, which are remarkably prevalent. In the United States, around 8,000 people with cystic fibrosis, 252,000 with Stargardt disease, 31,000 with phenylketonuria (PKU), and 43,500 with Duchenne muscular dystrophy have specific gene changes that could potentially be treated with therapies aimed at fixing these types of mutations.
“To my knowledge, this seems to be the only available gene therapeutic approach that is disease-agnostic,” said Wang. “Typically, we take one disease and one therapy approach. For a defective gene, we have to deliver that gene for treating that particular disease; that’s it. And for gene editing, it’s even more specific; it’s allele- or mutation-specific in many cases.”
The larger question now is how such a platform could move from the lab into the clinic—and who would shepherd it there. PERT is still early-stage science, but its architecture naturally aligns with commercial development. A disease- and gene-agnostic therapy that uses the same editor and only swaps out the pegRNA or suppressor backbone resembles a true platform technology, one that could amortize development costs across dozens of indications. If the editor itself doesn’t change, much of the safety, delivery, and manufacturing work could, in principle, be reused, lowering barriers for ultra-rare diseases that currently have no market justification.
Whether PERT ultimately falls under the umbrella of Prime Medicine—the company Liu co-founded to translate prime editing technologies—remains an open question. The IP landscape surrounding prime editing is already tightly interwoven among Harvard, the Broad Institute, and Prime Medicine, and any therapeutic built on prime editing’s core components would almost certainly intersect with that estate.
Still, whether PERT becomes a Prime Medicine program or a new venture, the broader implications remain the same: a single composition of matter that could serve as the backbone for dozens of rare-disease therapeutics would mark a fundamental shift in how genetic medicines are developed, regulated, and commercialized. For patients whose mutations have long been too rare to interest industry, a platform like PERT could finally make them visible—not one mutation at a time, but all at once.
Da:
https://mail1.virgilio.it/appsuite/#app=io.ox/mail&folder=default0/INBOX
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