Il caso del tagging endogeno / The Case for Endogenous Tagging

Il caso del tagging endogeno / The Case for Endogenous Tagging

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Superare gli artefatti ed acquisire una visione accurata della dinamica delle proteine

Comprendere il comportamento delle proteine ​​nei sistemi viventi è fondamenta di sovraespressione o metodi di rilevamento basati su anticorpi che possono distorle per la biologia. Tuttavia, per decenni, i ricercatori si sono affidati a modelli per dire la realtà all'interno delle cellule. La sovraespressione spesso spinge l'espressione proteica al di sopra dei livelli naturali, causando localizzazioni errate, interazioni alterate o funzioni artificiali. Nel frattempo, le prestazioni degli anticorpi primari variano notevolmente a seconda dei target e dei sistemi sperimentali.

Il tagging endogeno offre una visione più accurata. Etichettando le proteine ​​nel loro locus genomico, i ricercatori possono studiarle sotto regolazione nativa, consentendo il monitoraggio diretto di classi proteiche complesse come i recettori transmembrana e le proteine ​​di segnalazione.

Le linee cellulari HiBiT knock-in migliorano entrambi i metodi, consentendo di misurare e visualizzare le proteine ​​di interesse esattamente come espresse nella cellula, con elevata sensibilità, precisione quantitativa e senza bisogno di anticorpi primari.

Il tagging ad inserimento ha il sopravvento

Knock-in vs. sovraespressione

Quando le proteine ​​vengono sovraespresse da plasmidi o vettori virali, i risultati sono spesso distorti da artefatti. Livelli di espressione non fisiologici possono spingere le proteine ​​verso recettori che non occupano naturalmente od alterare le loro normali interazioni cellulari. Il tagging knock-in evita questo problema integrando un piccolo tag reporter direttamente nel plasmide endogeno.

locus utilizzando CRISPR/Cas9.

Il tag HiBiT è lungo 11 aminoacidi e ricostituisce la luciferasi NanoBiT® legandosi alla sua subunità complementare LgBiT, producendo una luminescenza brillante proporzionale all'abbondanza proteica. Le dimensioni compatte del tag riducono al minimo le interferenze, mentre il segnale luminoso e stabile consente il rilevamento a livelli endogeni reali.

Rilevamento basato su knock-in vs. anticorpi

La rilevazione basata su anticorpi primari rimane essenziale, ma può introdurre variabilità a causa delle differenze nella qualità, specificità e prestazioni degli anticorpi nei diversi test. Il tagging HiBiT offre un'alternativa più semplice e coerente: il sistema di tagging HiBiT fornisce misurazioni quantitative e riproducibili senza anticorpi primari o complesse fasi di rilevazione. Poiché la rilevazione della luminescenza è altamente adattabile, lo stesso tag supporta molteplici applicazioni, dai test su piastra all'imaging su cellule vive ed agli studi cinetici. Il tag HiBiT può anche essere rilevato utilizzando un anticorpo monoclonale altamente specifico, garantendo la compatibilità con i metodi tradizionali basati su epitopi come la citometria a flusso e l'arricchimento basato sull'immunoaffinità.

Esplora la stabilità, la dinamica e le interazioni delle proteine

Il tagging endogeno aiuta gli scienziati a dedicare meno tempo alla risoluzione dei problemi e più tempo alla scoperta di informazioni biologiche significative. Le linee cellulari HiBiT Knock-In consentono:

• Monitoraggio quantitativo dell'abbondanza proteica attraverso i trattamenti o nel tempo
• Visualizzazione della localizzazione subcellulare senza sovraespressione
• Monitoraggio della stabilità, del turnover e del degrado
• Esplorazione di complessi proteici endogeni o modifiche post-traduzionali (PTM) utilizzando approcci di spettrometria di massa immunoprecipitativa (IP-MS)

I ricercatori di Promega hanno utilizzato CRISPR/Cas9 per inserire il tag HiBiT in un sistema endogeno

Locus del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR). Il piccolo tag luminescente ha consentito il monitoraggio in tempo reale dell'internalizzazione del recettore dopo la stimolazione con il ligando. Le variazioni di luminescenza riflettevano direttamente l'attività del recettore e la localizzazione superficiale, fornendo dati rapidi e quantitativi su un processo di segnalazione dinamico fondamentale per la regolazione della crescita cellulare. Inoltre, i ricercatori hanno utilizzato l'IP-MS di EGFR-HiBiT per valutare gli interattori dell'EGFR e lo stato di fosforilazione. Questa stessa strategia può essere estesa ad un'ampia gamma di proteine ​​coinvolte nella segnalazione, nella degradazione e nella biologia dei recettori.

Percorsi facili per l'adozione

Mentre un tempo l'editing knock-in basato su CRISPR sembrava complesso, i recenti progressi hanno reso il tagging endogeno accessibile a quasi tutti i laboratori. I ricercatori possono scegliere tra tre metodi:

1. Linee cellulari HiBiT knock-in pronte all'uso per una rapida generazione e convalida dei dati.
2. Servizi e kit di tagging personalizzati per geni o modelli specifici o unici.
3. Crea le tue linee cellulari per un controllo sperimentale completo: sintetizza il DNA del donatore e ottieni i diritti per incorporare il tag HiBiT utilizzando un protocollo semplice.

Queste soluzioni flessibili incontrano i ricercatori dove si trovano: che si tratti di esplorare un singolo

obiettivo od ampliamento per il rilevamento e lo screening ad alto rendimento.

Conclusione

Il tagging endogeno combina la precisione di CRISPR/Cas9 con la sensibilità bioluminescente per una caratterizzazione proteica accurata e riproducibile, superando i limiti della rilevazione di anticorpi primari e supportando al contempo l'uso di anticorpi a valle. Questo approccio offre una visione più chiara della biologia proteica, che continua a guidare il progresso nella ricerca traslazionale e nella scoperta di farmaci.

ENGLISH

Overcoming artifacts and capturing an accurate view of protein dynamics

Understanding how proteins behave in living systems is central to biology. Yet, for decades, researchers have relied on overexpression models or antibody-based detection methods that can distort the reality inside cells. Overexpression often drives protein expression above natural levels, leading to mislocalization, altered interactions or artificial function. Meanwhile, primary antibody performance varies widely across targets and experimental systems.

Endogenous tagging offers a more accurate view. By labeling proteins at their genomic locus, researchers can study proteins under native regulation, enabling direct monitoring of complex protein classes like transmembrane receptors and signaling proteins.

HiBiT knock-in cell lines improve on both of those methods by making it possible to measure and visualize proteins of interest exactly as expressed in the cell—with high sensitivity, quantitative precision, and no primary antibodies required.

Knock-in tagging has the upper hand

Knock-in vs. overexpression

When proteins are overexpressed from plasmids or viral vectors, results are often misrepresented by artifacts. Non-physiological expression levels may push proteins into receptors they don’t naturally occupy or alter their normal cellular interactions. Knock-in tagging avoids this issue by integrating a small reporter tag directly into the endogenous

locus using CRISPR/Cas9.

The HiBiT tag is 11 amino acids long and reconstitutes NanoBiT® luciferase upon binding its complementary LgBiT subunit, producing bright luminescence proportional to protein abundance. Compact tag size minimizes interference while the bright, stable signal enables detection at true endogenous levels.

Knock-in vs. antibody-based detection

Primary antibody-based detection remains essential but can introduce variability due to differences in antibody quality, specificity, and performance across assays. HiBiT tagging provides a simpler, more consistent alternative: the HiBiT tagging system delivers quantitative, reproducible measurements without primary antibodies or complex detection steps. Because luminescence detection is highly adaptable, the same tag supports multiple applications, from plate-based assays to live-cell imaging and kinetic studies. The HiBiT tag can also be detected using a highly specific, monoclonal antibody, ensuring compatibility with traditional epitope-tag methods like flow cytometry and immunoaffinity-based enrichment.

Explore protein stability, dynamics, and interactions

Endogenous tagging helps scientists spend less time troubleshooting and more time uncovering meaningful biological information. HiBiT Knock-In cell lines enable:

• Quantitative tracking of protein abundance across treatments or time
• Visualization of subcellular localization without overexpression
• Monitoring of stability, turnover, and degradation
• Exploration of endogenous protein complexes or post-translational modifications (PTMs) using immunoprecipitation mass spectrometry (IP-MS) approaches

Researchers at Promega used CRISPR/Cas9 to insert the HiBiT tag into an endogenous

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) locus. The small luminescent tag allowed real-time monitoring of receptor internalization after ligand stimulation. Changes in luminescence directly reflected receptor activity and surface localization, providing rapid, quantitative data into a dynamic signaling process central to cell growth regulation. Additionally, researchers used IP-MS of EGFR-HiBiT to assess EGFR interactors and phosphorylation state. This same strategy can be extended to a wide range of proteins involved in signaling, degradation,

and receptor biology.

Easy paths to adoption

While CRISPR-based knock-in editing once seemed complex, recent advances have made endogenous tagging accessible for nearly any lab. Researchers can choose from three methods:

1. Ready-to-use HiBiT knock-in cell lines for rapid data generation and validation.
2. Custom tagging services and kits for specific or unique genes or models.
3. Build-your-own cell lines for full experimental control: synthesize donor DNA and obtain the rights to incorporate the HiBiT tag using a straightforward protocol.

These flexible solutions meet researchers where they are: whether exploring a single

target or scaling up for high-throughput detection and screening.

Conclusion

Endogenous tagging combines CRISPR/Cas9 precision with bioluminescent sensitivity for accurate, reproducible protein characterization, avoiding the limits of primary antibody detection while supporting downstream antibody use. This approach delivers a clearer view of protein biology that continues to drive progress in translational research and drug discovery.

Da:

https://www.genengnews.com/sponsored/the-case-for-endogenous-tagging/?_hsenc=p2ANqtz-8zHVGGw_how2vgsYDG66Vg8IZSt5LeNSGc7RvYD2m_96XQD3Dqb5JgNT_Sd-S9lnc_ZoZhDbRagSi-gk2_TIa10Yxz8JbY2GWSofVK2aJiw0Cwrmg&_hsmi=394017747