Il contrasto di fase indotto dal laser migliora la risoluzione della crio-microscopia elettronica per le piccole proteine / Laser‑Driven Phase Contrast Enhances Cryo‑EM Resolution of Small Proteins
Il contrasto di fase indotto dal laser migliora la risoluzione della crio-microscopia elettronica per le piccole proteine / Laser‑Driven Phase Contrast Enhances Cryo‑EM Resolution of Small Proteins
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Avete presente quando andate dall'oculista per un aggiornamento della prescrizione ed improvvisamente il mondo vi appare più nitido? I fisici dell'Università della California (UC) di Berkeley hanno fatto qualcosa di simile per la microscopia elettronica. Introducendo il contrasto di fase in un microscopio crioelettronico, hanno ottenuto immagini notevolmente più nitide di alcune delle proteine più piccole e sfuggenti della biologia.
Il progresso deriva da una nuova piastra di fase laser (LPP), descritta nell'articolo " Laser phase plate improves structure determination of small proteins by cryo-EM ", pubblicato di recente su Science . Il team, guidato dal fisico Holger Mueller, PhD, dell'UC Berkeley e del Lawrence Berkeley National Laboratory, ha dimostrato che una piastra di fase azionata da laser può superare una delle limitazioni più persistenti della crio-microscopia elettronica: lo scarso contrasto per le proteine di piccole dimensioni.
La crio-microscopia elettronica (Cryo-EM) ha rivoluzionato la biologia strutturale nell'ultimo decennio, aggiudicandosi il Premio Nobel nel 2017 per aver permesso di ottenere strutture ad alta risoluzione senza cristallizzazione. Nonostante il suo impatto, la tecnica presenta ancora difficoltà con le proteine di dimensioni inferiori a circa 70 kilodalton, un intervallo che comprende circa il 90% del proteoma umano. "A causa dei limiti del rapporto segnale/rumore, la maggior parte delle proteine umane ed animali sono troppo piccole per essere analizzate con questi metodi [crio-EM e criotomografia elettronica]. Si prevede che l'aumento del rapporto segnale/rumore fornito da questa piastra di fase laser supererà questi importanti limiti."
Il nuovo LPP inizia ad affrontare questo problema. L'LPP utilizza un laser ad alta intensità ed ad onda continua per modificare la fase del fascio di elettroni. Questo produce un vero contrasto di fase senza attenuare o destabilizzare il fascio. Mueller ha descritto la messa a fuoco del laser come "75 kilowatt focalizzati su pochi micron... È più potente di quello che si usa per la saldatura. Ha più potenza di un laser militare. Crea la messa a fuoco laser continua più brillante mai realizzata".
Installata in un microscopio Thermo Fisher Titan Krios personalizzato, la piastra di fase laser (LPP) ha immediatamente migliorato la chiarezza e la risolvibilità delle piccole proteine, inclusa l'emoglobina, che si trova al limite inferiore di ciò che gli attuali strumenti di crio-microscopia elettronica sono in grado di gestire. Come scrivono gli autori nell'abstract: "Qui dimostriamo che la piastra di fase laser (LPP)... migliora la risoluzione nella ricostruzione di singole particelle di piccole proteine, ottimizzando la correzione del movimento del campione, il recupero delle informazioni dai primi fotogrammi, nonché la visualizzazione delle particelle, la classificazione 3D e l'allineamento."
Questi miglioramenti sono stati ottenuti utilizzando intervalli di defocus e flussi di lavoro di ricostruzione standard. "Nei casi più difficili, come particelle piccole o campioni di scarsa qualità, il laser offre un vantaggio davvero considerevole", ha affermato Mueller.
L'impatto va oltre l'analisi di singole particelle. La tomografia crioelettronica (cryo-ET), che assembla diverse viste angolari di una molecola o proteina in un'immagine tridimensionale, ne trarrà un beneficio ancora maggiore. "Con la cryo-ET, osserviamo materiale cellulare piccolo e molto complesso, incredibilmente denso all'interno della cellula", ha affermato Bridget Carragher, PhD, direttrice tecnica fondatrice del settore imaging presso Biohub. "È come una foresta di alberi, e si cerca di trovare una singola foglia su un albero. La cryo-ET necessita di un notevole miglioramento del contrasto, in modo da poter iniziare a vedere cosa succede all'interno della cellula. Questo è ciò che la piastra di fase laser promette di offrirci."
Biohub sta sviluppando una versione a doppio laser del sistema, progettata per ridurre l'usura dei componenti e minimizzare le aberrazioni. Nel frattempo, il gruppo di Mueller si sta impegnando per ottenere immagini di proteine di dimensioni fino a 17 kilodalton, una soglia che aprirebbe l'accesso a vaste regioni del proteoma umano precedentemente invisibili alla crio-microscopia elettronica.
"Questa tecnologia rappresenta un cambiamento epocale per la biologia " , ha affermato Stephani Otte, PhD, vicepresidente per la scienza dell'imaging di Biohub. "Ciò che prima era invisibile diventerà visibile, e questo cambierà radicalmente il modo in cui comprendiamo le malattie."
"In definitiva, se si ha una proteina di grandi dimensioni ed un campione davvero buono, ad esempio fresco o congelato senza bolle, potrebbe non essere necessaria la piastra di fase per ottenere un'immagine singola di alta qualità. Ma per una proteina piccola ed un campione di scarsa qualità, l'utilizzo del laser è la soluzione migliore", ha affermato Mueller. "Questo potrebbe colmare un'enorme lacuna nella nostra conoscenza delle strutture proteiche che non possono essere cristallizzate o sono troppo piccole per la crio-microscopia elettronica attuale. E sarà rivoluzionario per la crio-tomografia elettronica."
ENGLISH
You know when you are at the eye doctor getting an updated prescription, and suddenly the world snaps into sharper focus? Physicists at the University of California (UC), Berkeley, have now done something similar for electron microscopy. By introducing phase contrast into a cryo‑electron microscope, they have delivered dramatically sharper images of some of biology’s smallest and most elusive proteins.
The advance comes from a new laser phase plate (LPP), described in the paper “Laser phase plate improves structure determination of small proteins by cryo‑EM,” which was published recently in Science. Led by physicist Holger Mueller, PhD, of UC Berkeley and Lawrence Berkeley National Laboratory, the team demonstrated that a laser‑driven phase plate can overcome one of cryo‑EM’s most persistent limitations: poor contrast for small proteins.
Cryo‑EM has transformed structural biology over the past decade, earning a Nobel Prize in 2017 for enabling high‑resolution structures without crystallization. But despite its impact, the technique still struggles with proteins below ~70 kilodaltons—a size range that includes about 90% of the human proteome. “Because of signal-to-noise limitations, the majority of human and animal proteins are too small to be analyzed by these methods [cryo-EM and cryoelectron tomography]. The increase in signal-to-noise ratio provided by this laser phase plate is expected to overcome these important limitations.”
The new LPP begins to address that problem. The LPP uses an intense, continuous‑wave laser to shift the phase of the electron beam itself. This produces true phase contrast without dimming or destabilizing the beam. Mueller described the laser focus as “75 kilowatts focused to a few microns… That’s more powerful than what you use for welding. It has more power than a military laser. It builds up the brightest continuous laser focus ever.”
Installed in a custom Thermo Fisher Titan Krios, the LPP immediately improved the clarity and resolvability of small proteins, including hemoglobin, which sits at the lower limit of what today’s cryo‑EM instruments can handle. As the authors wrote in the abstract: “Here, we show that the laser phase plate (LPP)… enhances the resolution in single-particle reconstruction of small proteins by improving specimen-motion correction, recovery of information from the early frames, as well as particle visualization, 3D classification, and alignment.”
These improvements were achieved using standard defocus ranges and reconstruction workflows. “For the most challenging cases—small particles, bad specimens—the laser produces a very considerable advantage,” Mueller said.
The impact extends beyond single‑particle analysis. Cryo‑electron tomography (cryo‑ET), which assembles multiple angular views of a molecule or protein into a three-dimensional image, stands to benefit even more. “With cryo-ET, we’re looking at small, very complicated cellular material that’s incredibly crowded inside the cell,” said Bridget Carragher, PhD, founding technical director of imaging at Biohub. “It’s like a forest of trees, and you’re trying to find one leaf on one tree in there. Cryo-ET needs a dramatic step forward in contrast, so we can start to see what’s going on inside the cell. That’s what the laser phase plate promises to give us.”
Biohub is developing a dual‑laser version of the system, designed to reduce component wear and minimize aberrations. Meanwhile, Mueller’s team is pushing toward imaging proteins as small as 17 kilodaltons, a threshold that would open access to vast regions of the human proteome previously invisible to cryo‑EM.
“This technology is a step function change for biology,” said Stephani Otte, PhD, Biohub’s vice president of imaging science. “What was once invisible will become visible—and that changes everything about how we understand disease.”
“The bottom line is, if you have a large protein and a really good sample—a fresh one or one frozen without bubbles, for example—you may not need the phase plate to get a single, high-quality image. But for a small protein and a bad sample, laser-on is best,” Mueller said. “This could fill an enormous gap in our knowledge of protein structures that can’t be crystallized or are too small for today’s cryo-EM. And it will be revolutionary for cryo-ET.”
Da:
https://www.genengnews.com/topics/drug-discovery/laser%E2%80%91driven-phase-contrast-enhances-cryo%E2%80%91em-resolution-of-small-proteins/?_hsenc=p2ANqtz-8oxDbHX4UdpAjPO6SFFmKXG9fmkasFUKdD6PC3bE7sdpUxYR3ShhZw35oz4xGuA7jLxg9u2TpnWumaU5zR5CVFb9GyD1-HMoZk9YN0N0Ai0d27BsU&_hsmi=423526632
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