La variante CRISPR "Kill Switch" distrugge il DNA delle cellule malate. / “Kill Switch” CRISPR Variant Shreds the DNA of Diseased Cells
La variante CRISPR "Kill Switch" distrugge il DNA delle cellule malate. / “Kill Switch” CRISPR Variant Shreds the DNA of Diseased Cells
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
La tecnologia basata su Cas12a2 è in grado di colpire le cellule cancerose o infettate da virus, lasciando intatte le cellule sane, e si prospetta promettente per il trattamento di diverse malattie.
Un nuovo tipo di CRISPR
"La maggior parte degli enzimi CRISPR, come Cas9, sono progettati per effettuare un taglio preciso in una specifica sequenza di DNA al fine di modificare i geni", ha dichiarato a Technology Networks il dottor Yang Liu, professore assistente all'Università dello Utah ed uno degli autori senior del nuovo studio . "Al contrario, Cas12a2 agisce più come un 'interruttore di spegnimento' molecolare".
Come altri sistemi CRISPR-Cas, Cas12a2 si lega ad una specifica sequenza di acidi nucleici. Tuttavia, una volta riconosciuto il suo RNA bersaglio, Cas12a2 si attiva ed inizia a causare danni estesi al DNA, portando alla morte cellulare. Se CRISPR/Cas9 agisce come un paio di forbici controllate con precisione, CRISPR/Cas12a2 agisce come un distruggidocumenti.
Utilizzando una sequenza di RNA bersaglio presente solo nelle cellule malate, i ricercatori possono sfruttare il potere distruttivo di Cas12a2 a fin di bene.
"Cas12a2 combina questa potente attività di danneggiamento del DNA e di uccisione cellulare con un'altissima specificità", ha spiegato Liu. "È in grado di distinguere anche differenze di un singolo nucleotide, consentendo di colpire selettivamente le cellule tumorali che presentano mutazioni specifiche o le cellule infettate da sequenze virali, risparmiando al contempo le cellule sane."
Utilizzo di Cas12a2 per distruggere le cellule tumorali
Le cellule malate spesso contengono molecole di RNA uniche.
"Nel cancro, queste molecole possono essere RNA mutanti o RNA infettati da virus che promuovono la crescita del tumore", ha affermato Liu. "Abbiamo programmato Cas12a2 con RNA guida progettati per riconoscere queste sequenze di RNA specifiche della malattia."
KRAS è uno degli oncogeni più frequentemente mutati. Con una singola mutazione genetica, la proteina K-Ras rimane bloccata nella sua conformazione "attiva", innescando una crescita tumorale incontrollata.
Questa singola mutazione genetica, G12C, ha offerto a Liu ed al suo gruppo l'opportunità di utilizzare Cas12a2 contro le cellule tumorali.
Innanzitutto, hanno identificato un potenziale RNA guida (gRNA) che ha come bersaglio il trascritto KRAS G12C. Successivamente, in linee cellulari
che sovraesprimevano il KRAS di tipo selvatico od il trascritto KRAS G12C, hanno introdotto Cas12a2 dotato del gRNA.
Cas12a2 ha ridotto del 62% la linea cellulare che esprime KRAS G12C, ma non ha ridotto in modo significativo la linea cellulare che esprime KRAS di tipo selvatico .
Nelle cellule tumorali che presentano naturalmente la mutazione KRAS G12C, Cas12a2 con lo stesso gRNA ha ridotto la crescita cellulare del 50%.
I ricercatori si sono quindi chiesti se la Cas12a2 mirata alla mutazione KRAS G12C potesse integrare la strategia terapeutica esistente per i tumori con mutazione KRAS. Il trattamento con il solo sotorasib ha ridotto le cellule tumorali del 65%, ma l'aggiunta della Cas12a2 mirata alla mutazione KRAS G12C ha aumentato questa percentuale all'85%. Nelle cellule che avevano sviluppato resistenza al sotorasib, la Cas12a2 mirata alla mutazione KRAS G12C ha ridotto la crescita di oltre il 50%.
In questi test, l'approccio basato su Cas12a2 ha funzionato in modo simile ai farmaci antitumorali tradizionali, ma a differenza dei chemioterapici, Cas12a2 non danneggia le cellule sane, il che potrebbe tradursi in una riduzione degli effetti collaterali.
Cas12a2 uccide le cellule infette da HPV
Liu ed i suoi collaboratori hanno anche studiato se Cas12a2 potesse eliminare le cellule che ospitano ceppi ad alto rischio del papillomavirus umano (HPV), che sono stati collegati al cancro.
Poiché le trascrizioni virali sono presenti solo nelle cellule infette, ciò ha offerto numerosi bersagli per le gRNA. L'utilizzo di gRNA mirate alle trascrizioni di HPV che codificano per le proteine oncogeniche E6 o E7 ha portato ad una robusta attivazione di Cas12a2 nelle cellule infette da HPV , riducendo il numero di cellule del 94%.
È importante sottolineare che le cellule che non contenevano HPV non sono state influenzate dal trattamento con Cas12a2.
"Naturalmente, qualsiasi applicazione terapeutica richiederà comunque un'ampia validazione per garantire che ogni modello di guida eviti attività indesiderate nei tessuti sani", ha affermato Liu.
Oltre KRAS e HPV
La natura programmabile di Cas12a2 significa che potrebbe essere utilizzato contro molti tipi di bersagli di RNA per combattere diverse malattie.
"Come Cas9, Cas12a2 può essere facilmente riprogrammato per colpire praticamente qualsiasi sequenza di RNA di interesse nelle cellule malate, semplicemente cambiando l'RNA guida", ha spiegato Liu. "In questo senso, è una piattaforma altamente adattabile, a patto che riusciamo a identificare sequenze di RNA che siano uniche per le cellule danneggiate e assenti in quelle sane."
Poiché molte malattie alterano l'espressione dell'RNA, le potenziali applicazioni di Cas12a2 sono ampie.
"Oltre al cancro ed alle malattie infettive, potrebbero esserci opportunità anche nel campo delle malattie del sangue e neurodegenerative, se fosse possibile definire specifiche popolazioni di cellule patogene mediante firme di RNA distinte", ha osservato Liu.
Verso terapie umane
C'è ancora molta strada da fare prima che Cas12a2 possa essere utilizzato negli esseri umani. Poiché la maggior parte della ricerca su Cas12a2 è stata condotta in vitro, permangono interrogativi sui suoi potenziali effetti fuori bersaglio in sistemi complessi.
"Sebbene Cas12a2 possa essere altamente specifico, soprattutto quando si tratta di colpire RNA mutanti o virali unici, dobbiamo comunque testarlo attentamente ed assicurarci che non danneggi involontariamente cellule o tessuti sani", ha spiegato Liu. "Abbiamo anche bisogno di una comprensione molto più approfondita di come le cellule rispondono all'attivazione di Cas12a2, comprese le eventuali risposte immunitarie."
Come altre terapie basate su CRISPR, Cas12a2 si trova ad affrontare un ostacolo importante nella sua somministrazione alle cellule bersaglio. "Una delle maggiori sfide è la somministrazione", ha affermato Liu. "Abbiamo bisogno di metodi efficienti e sicuri per veicolare il sistema Cas12a2 all'interno delle cellule del corpo".
Prima che Cas12a2 possa essere introdotto nella pratica clinica, saranno necessari studi preclinici approfonditi per valutare la sicurezza e la specificità sia nei modelli animali che nei campioni dei pazienti.
Nonostante la lunga strada da percorrere per arrivare alle terapie sull'uomo, Liu ed il suo gruppo sono ottimisti riguardo alle possibilità offerte da Cas12a2. "L'eliminazione cellulare mediata da Cas12a2 rappresenta un'aggiunta unica ed importante alla cassetta degli attrezzi CRISPR-Cas", affermano nell'articolo.
ENGLISH
A CRISPR system called Cas12a2 kills diseased cells by triggering widespread DNA damage after RNA recognition.
CRISPR is best known as a gene editing technology, but a newly discovered CRISPR system offers a way to kill diseased cells—by ripping their DNA apart.
The Cas12a2-based technology can target harmful cancer or virus-infected cells while leaving healthy cells untouched, offering promise for treating various diseases.
A new kind of CRISPR
“Most CRISPR enzymes, such as Cas9, are designed to make a precise cut at a specific DNA sequence to edit genes,” Dr. Yang Liu, an assistant professor at the University of Utah and one of the senior authors of the new work, told Technology Networks. “In contrast, Cas12a2 acts more like a molecular ‘kill switch’.”
Like other CRISPR-Cas systems, Cas12a2 targets a specific nucleic acid sequence. However, once it recognizes its target RNA, Cas12a2 is activated and starts causing extensive DNA damage, leading to cell death. If CRISPR/Cas9 acts like a precisely controlled pair of scissors, CRISPR/Cas12a2 acts like a paper shredder.
By using a target RNA sequence that is only present in diseased cells, the researchers can harness the destructive power of Cas12a2 for good.
“Cas12a2 combines this potent DNA-damaging and cell-killing activity with very high specificity,” explained Liu. “It can distinguish even single-nucleotide differences, allowing it to selectively target cancer cells carrying specific mutations or cells infected with viral sequences, while sparing healthy cells.”
Using Cas12a2 to destroy cancer cells
Diseased cells often contain unique RNA molecules.
“In cancer, these molecules can be mutant RNAs or virally infected RNAs that promote tumor growth,” said Liu. “We programmed Cas12a2 with guide RNAs designed to recognize these disease-specific RNA sequences.”
KRAS is one of the most frequently mutated oncogenes. With a single gene mutation, the K-Ras protein becomes stuck in its “on” conformation, triggering uncontrolled tumor growth.
This single gene mutation, G12C, offered Liu and his team an opportunity to employ Cas12a2 against cancer cells.
Firstly, they identified a guide RNA (gRNA) candidate that targets the KRAS G12C transcript. Then, in cell lines that overexpressed either wild-type KRAS or the KRAS G12C transcript, they introduced Cas12a2 equipped with the gRNA.
Cas12a2 depleted the KRAS G12C – expressing cell line by 62% and didn’t measurably deplete the wild-type KRAS-expressing cell line.
In cancer cells that naturally harbor the KRAS G12C mutation, Cas12a2 with the same gRNA reduced cell growth by 50%.
The researchers then asked whether KRAS G12C –targeting Cas12a2 could complement the existing treatment strategy for KRAS-mutated cancers. Treatment with sotorasib alone depleted cancer cells by 65%, but the addition of KRAS G12C – targeting Cas12a2 increased this to 85%. For cells that had acquired resistance to sotorasib, KRAS G12C –targeting Cas12a2 reduced growth by over 50%.
The Cas12a2 approach worked about as well as established anticancer drugs in these tests, but unlike chemotherapeutics, Cas12a2 doesn’t affect healthy cells, which could translate to a reduction in side effects.
Cas12a2 kills cells infected with HPV
Liu and his collaborators also investigated whether Cas12a2 could eliminate cells that harbor high-risk strains of human papillomavirus (HPV), which have been linked to cancer.
As the viral transcripts are only present in infected cells, this offered numerous targets for gRNAs. Using gRNAs targeting HPV transcripts encoding oncogenic E6 or E7 proteins led to robust Cas12a2 activation in HPV-infected cells, reducing cell numbers by 94%.
Importantly, cells that didn’t contain HPV were unaffected by the Cas12a2 treatment.
“Of course, any therapeutic application will still require extensive validation to ensure that each guide design avoids unintended activity in healthy tissues,” said Liu.
Beyond KRAS and HPV
The programmable nature of Cas12a2 means it could be used against many types of RNA targets to tackle different diseases.
“Like Cas9, Cas12a2 can be easily reprogrammed to target virtually any RNA sequence of interest in diseased cells simply by changing the guide RNA,” explained Liu. “In that sense, it is a highly adaptable platform, as long as we can identify RNA sequences that are unique to the harmful cells and absent from healthy ones.”
As many diseases alter RNA expression, the potential applications of Cas12a2 are broad.
“Beyond cancer and infectious disease, there may also be opportunities in blood and neurodegenerative disorders if specific pathogenic cell populations can be defined by distinct RNA signatures,” noted Liu.
Towards human therapies
There is still a way to go before Cas12a2 can be used in humans. As the majority of research on Cas12a2 has been performed in vitro, questions remain surrounding its potential off-target effects in whole systems.
“Although Cas12a2 can be highly specific, especially when targeting unique mutant or viral RNAs, we still need to carefully test and ensure it does not unintentionally damage healthy cells or tissues,” Liu explained. “We also need a much deeper understanding of how cells respond to Cas12a2 activation, including any possible immune responses.”
Like other CRISPR-based therapeutics, Cas12a2 faces a major hurdle in its deliverability to target cells. “One of the biggest challenges is delivery,” said Liu. “We need efficient and safe ways to deliver the Cas12a2 system into cells inside the body.”
Extensive preclinical studies to assess safety and specificity in both animal models and patient samples will also be needed before Cas12a2 makes its way to the clinic.
Despite the long road to in-human therapies, Liu and his team are optimistic about the possibilities that Cas12a2 offers. “Cas12a2-mediated cell elimination represents a unique and important entry into the CRISPR–Cas toolbox,” they say in the paper.
Da:
https://www.technologynetworks.com/genomics/news/kill-switch-crispr-variant-shreds-the-dna-of-diseased-cells-412874?utm_campaign=NEWSLETTER_TN_Breaking%20Science%20News&utm_medium=email&_hsenc=p2ANqtz-_9kOUFvRGXWJUsZvondAwBGi4PPfbhwcn-W7GOZUyfkF0cr0maAcVRw-rZYcB35U8OKt_PiVKTnDz5IUAvja2GRGgP3vhee60ZjrGW1yAFQIw44-M&_hsmi=424650335&utm_content=424650335&utm_source=hs_email
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