Punti critici nella terapia cellulare e genica: gli ostacoli che impediscono ai pazienti di accedere alle cure. / Bottlenecks in Cell and Gene Therapy: Steps That Separate Patients From Treatment

Punti critici nella terapia cellulare e genica: gli ostacoli che impediscono ai pazienti di accedere alle cure. / Bottlenecks in Cell and Gene Therapy: Steps That Separate Patients From Treatment

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

I metodi di separazione cellulare influenzano la resa, la vitalità e la scalabilità nelle terapie cellulari e geniche.

Le terapie cellulari hanno rivoluzionato il trattamento di patologie un tempo considerate incurabili, tra cui i tumori del sangue e le malattie genetiche come l'anemia falciforme.

Quest'ultima, nota come anemia falciforme, colpisce oltre 8 milioni di persone in tutto il mondo; provoca la deformazione a falce dei globuli rossi, che possono accumularsi all'interno dei vasi sanguigni ed occluderli. Questi episodi non solo sono dolorosi, ma anche gravi, a volte potenzialmente letali, poiché possono compromettere il flusso sanguigno agli organi vitali. La malattia richiede un trattamento a vita: una serie di farmaci specifici volti a prevenire la deformazione a falce, controllare il dolore e ridurre il rischio di complicanze.

Tuttavia, negli ultimi anni si è riaccesa la speranza con l'approvazione da parte della Food and Drug Administration statunitense delle prime terapie geniche cellulari per l'anemia falciforme. Questi trattamenti, da effettuare in un'unica seduta, promettevano ai pazienti una " nuova vita ", libera dalle catene della gestione dei sintomi.

Con centinaia di nuove terapie cellulari e geniche in fase di sviluppo per malattie incurabili, molti pazienti vivono nella speranza di poter un giorno avere la stessa opportunità. Migliaia di terapie saranno testate ed alcune saranno approvate, ma quanti pazienti potranno riceverle?

Per analizzare i colli di bottiglia nello sviluppo di terapie cellulari scalabili, Technology Networks ha intervistato la Dott.ssa Sophie He, vicepresidente della divisione terapia cellulare di Bracco. La Dott.ssa He ha esaminato gli attuali standard di produzione del settore e le limitazioni che questi impongono sia alla produzione che all'accesso dei pazienti.

Izzy Hirst (IH):

Quali sono le fasi chiave del processo di produzione della terapia cellulare e dove si colloca la fase di separazione all'interno di questo processo?

Sophie He, PhD (SH):

Il processo standard di produzione di terapie cellulari comprende lavaggio, selezione (o separazione) delle cellule, attivazione, trasduzione, espansione, ulteriore lavaggio, formulazione e riempimento. La separazione è una fase iniziale cruciale perché influisce non solo sulla purezza e sulla resa, ma anche sulla vitalità e sulla salute delle cellule. Ciascuno di questi fattori incide sul successo della terapia cellulare prodotta.

Separazione cellulare nella produzione di terapie cellulari

Questo è il processo di isolamento delle cellule desiderate dai campioni dei pazienti. Rimuove le cellule indesiderate, i detriti cellulari e le tossine, con l'obiettivo di produrre lotti uniformi di cellule vitali. Le tecniche comuni di separazione cellulare includono.

Separazione cellulare immunomagnetica: le microsfere magnetiche sono rivestite di anticorpi che si legano alle cellule desiderate, assicurando che rimangano in posizione durante il lavaggio.

Citometria a flusso con selezione cellulare attivata dalla fluorescenza: le cellule passano attraverso un laser e vengono selezionate in base ai modelli di fluorescenza e di diffusione della luce.

Centrifugazione a gradiente di densità: la rotazione di campioni eterogenei provoca la separazione delle cellule in strati in base alla densità ed alle dimensioni.

Storicamente, la separazione cellulare è stata effettuata separatamente dall'attivazione cellulare, allungando i tempi del processo. Le nuove metodologie combinano la selezione e l'attivazione cellulare, riducendo i tempi di elaborazione e il numero di passaggi, pur ottenendo gli stessi risultati. In particolare, la tecnologia di selezione utilizzata può influenzare anche le strategie successive in ambito chimico, produttivo e di controllo, la compatibilità con l'automazione e la scalabilità produttiva a lungo termine.

Alcuni processi produttivi richiedono una fase di arricchimento aggiuntiva prima della formulazione finale per garantire che il prodotto finale sia privo di tipi cellulari indesiderati. Pertanto, la separazione cellulare è un processo produttivo fondamentale, non solo per ottenere il materiale di partenza corretto, ma anche, in questi casi, per garantire che il prodotto finale rientri nelle specifiche.

(IH): Perché popolazioni cellulari come le cellule staminali ematopoietiche (CSE) sono particolarmente vulnerabili durante la separazione, rispetto ad altri tipi di cellule?

SH: Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono particolarmente vulnerabili durante la separazione cellulare perché costituiscono una popolazione rara; risiedono principalmente nel midollo osseo e rappresentano appena lo 0,01% del totale delle cellule nucleate. Sono inoltre altamente sensibili a stress come le forze di taglio, che possono influire negativamente sulla loro efficacia clinica.

Per popolazioni cellulari rare come le cellule staminali ematopoietiche (HSC), il fattore limitante per la commercializzazione è spesso la necessità di ottenere una resa sufficiente con un elevato grado di purezza. Le metodologie tradizionali, come la separazione magnetica, possono imporre compromessi tra purezza e resa e richiedono fasi di manipolazione che incidono in modo sproporzionato sulle popolazioni cellulari più delicate.

Anche la scalabilità rappresenta una sfida, poiché metodi come le microsfere magnetiche, efficaci su piccola scala, non sempre si traducono agevolmente nella produzione su larga scala. Questo problema può essere superato adottando nuove tecnologie, come gli approcci basati sulle microbolle , che possono essere efficacemente scalati dal laboratorio alla produzione industriale.

IH: Quali limitazioni tecniche e biologiche avete riscontrato nello studio della separazione magnetica, l'attuale standard del settore

SH: Alcune limitazioni sono ormai diventate la norma, come ad esempio la necessità di hardware aggiuntivo per la colonna, operazioni unitarie extra, flessibilità limitata nel tipo e nella sequenza di selezione e il rischio intrinseco derivante da materiali magnetici residui a valle. Ciò può potenzialmente influire sull'elettroporazione, con il rischio di fallimento del lotto.

Abbiamo inoltre osservato stress cellulare e perdita di resa dovuti a forze di taglio quando si utilizza la separazione magnetica.

Sfide nella separazione magnetica delle cellule

La separazione cellulare mediante microattivazione magnetica (MAC) presenta numerose sfide. La dipendenza dagli anticorpi introduce un rumore di fondo, che può essere causato da cellule morte, cellule indesiderate con espressione proteica simile a quella della cellula bersaglio e legami non specifici. Se la percentuale di cellule desiderate nel materiale di partenza è bassa, il rumore di fondo può aumentare. Inoltre, la separazione implica una manipolazione meccanica, che può compromettere l'integrità cellulare.

IH: In che modo queste limitazioni influenzano la producibilità a valle e la coerenza del dosaggio per le terapie monodose, come i trattamenti per l'anemia falciforme?

SH:Le terapie geniche per l'anemia falciforme hanno costantemente dovuto affrontare problemi di resa, con un recupero insufficiente di cellule CD34+ che ha impedito la produzione di dosi efficaci e limitato i lanci commerciali.

Cellule CD34+ nella terapia genica dell'anemia falciforme

CD34+ è un marcatore delle cellule staminali ematopoietiche, che costituiscono la base per le terapie geniche contro l'anemia falciforme. Queste cellule vengono isolate durante il processo di produzione.

La resa può essere direttamente correlata alla metodologia di separazione scelta, quindi è fondamentale optare per tecniche ad alta efficienza che lascino residui minimi o nulli. Ciò contribuisce a ridurre l'amplificazione delle inefficienze a valle, come ad esempio la necessità di un lungo periodo di espansione a causa del basso numero di cellule selezionate.

Nei casi in cui la vita di un paziente dipende dalla buona riuscita della produzione di un singolo trattamento, un eventuale fallimento può rappresentare un pericolo per il paziente, comportare costi enormi e la perdita di tempo prezioso. 

IH: Guardando al futuro, cosa ritiene che le tecnologie di separazione cellulare di prossima generazione debbano offrire per garantire uniformità e scalabilità nelle terapie cellulari?

SH: Sono necessari alcuni requisiti. Innanzitutto, la tecnologia deve essere delicata e preservare la funzionalità della popolazione cellulare bersaglio. Date le limitazioni delle tecnologie esistenti, un approccio biocompatibile che non lasci residui magnetici potrebbe contribuire a preservare la vitalità e la funzionalità delle popolazioni cellulari bersaglio.

In secondo luogo, come settore industriale, dobbiamo sviluppare processi di produzione per la terapia cellulare che ci consentano di trattare un maggior numero di pazienti. Ciò può essere raggiunto solo semplificando il processo e rendendolo economicamente vantaggioso. Disporre di un'unica tecnologia di separazione scalabile, utilizzabile per la selezione cellulare positiva, negativa e sequenziale, potrebbe essere fondamentale per consentire l'arricchimento di fenotipi cellulari complessi. Potrebbe aiutare i ricercatori a perfezionare i loro flussi di lavoro nelle prime fasi di sviluppo del processo, offrendo maggiore flessibilità e scalabilità.

Infine, le tecnologie di separazione cellulare di nuova generazione devono essere compatibili con flussi di lavoro chiusi ed automatizzati conformi alle Buone Pratiche di Fabbricazione (GMP), in linea con le tendenze del settore verso la digitalizzazione ed il contenimento.

ENGLISH

Cell separation methods influence yield, viability, and scalability in cell and gene therapies.

Cell therapies have revolutionized treatment for conditions once considered incurable, including blood cancers and genetic disorders such as sickle cell disease (SCD).

The latter, SCD, affects more than 8 million individuals worldwide; it results in sickling, or misshaping, of red blood cells, which can accumulate within and occlude blood vessels. Not only are these episodes painful, but they are also serious—sometimes life-threatening—given that the blood flow to major organs can be affected. The condition requires lifelong treatment: an assortment of tailored medications aiming to prevent cell sickling, control pain, and reduce the risk of complications.

However, hope came in recent years with the US Food and Drug Administration’s approval of the first cell-based gene therapies for SCD. These one-and-done treatments promised patients a “new life,” free from the shackles of symptom management.

With hundreds of novel cell and gene therapies in development for incurable conditions, many patients live in hope of one day receiving the same opportunity. Thousands of therapies will be tested, and some will be approved, but how many patients will receive them?

To explore the bottlenecks in scalable cell therapies, Technology Networks sat down with Dr. Sophie He, vice president of cell therapy at Bracco. She explored current industry manufacturing standards and the limitations they impose on both production and patient access.

Izzy Hirst (IH): What are the key stages of the cell therapy manufacturing pipeline, and where does the separation step fit within this?

Sophie He, PhD (SH): The standard cell therapy manufacturing process includes washing, cell selection (or separation), activation, transduction, expansion, further washing, formulation, and fill. Separation is a critical early step because it affects not just purity and yield, but also cell viability and health. Each of these factors affects the success of manufactured cell therapy.

Cell separation in cell therapy manufacturing

This is the process of isolating the desired cells from patient samples. It removes unwanted cells, cell debris, and toxins, aiming to produce uniform batches of viable cells. Common cell separation techniques include.

Immunomagnetic cell separation: Magnetic beads are coated with antibodies that bind the desired cells, ensuring that they are held in place during washing.

Fluorescence-activated cell sorting: Cells pass through a laser and are sorted based on fluorescence and light-scattering patterns.

Density gradient centrifugation: Spinning heterogeneous samples causes cells to separate into layers based on density and size.

Cell separation has historically been done separately from cell activation, prolonging the process. New methodologies combine cell selection and activation, shortening processing time and reducing the number of steps while still yielding the same results. Notably, the selection technology used can also shape downstream chemistry, manufacturing, and controls strategy, automation compatibility, and long-term manufacturing scalability.

Some manufacturing processes require an additional enrichment step before final formulation to guarantee the final product is free of undesired cell types. Therefore, cell separation is a key manufacturing process, not only to get the right starting material but also, in these cases, to ensure the final product is within specifications. 

IH: Why are populations such as hematopoietic stem cells (HSCs) particularly vulnerable during separation, compared to other cell types?

SH: HSCs are especially vulnerable during cell separation because they are a rare population; they primarily reside in the bone marrow and account for as little as 0.01% of total nucleated cells. They are also highly sensitive to stress such as shear forces that can negatively impact their clinical effectiveness.

For rare cell populations like HSCs, the limiting factor for commercial rollout is often the generation of sufficient yield with high purity. Traditional methodologies, such as magnetic separation, can force compromises between purity and yield and require handling steps that disproportionately affect fragile populations.

Scalability is also a challenge, as methods like magnetic beads that work at a small scale don’t always translate cleanly to scaled production. This can be overcome by adopting novel technologies, such as microbubble-based approaches, which can scale effectively from laboratory to manufacturing.

IH: What technical and biological limitations have you observed in investigating magnetic separation, the current industry standard?

SH: Certain limitations have become normalized, such as additional column hardware, extra unit operations, limited flexibility in selection type and sequence, and the inherent risk from residual magnetic materials downstream. This can potentially impact electroporation, risking batch failure.

We’ve also seen cell stress and yield loss due to sheer forces when magnetic separation is used.

Challenges in magnetic cell separation

There are many challenges in magnetic-activated cell sorting. Dependence on antibodies opens the door to background noise, which can be contributed to by dead cells, undesired cells with similar protein expression to the target cell, and non-specific binding. If the percentage of desired cells in the starting material is low, background noise can increase. Furthermore, sorting involves mechanical manipulation, which can compromise cellular integrity.

IH: How do these limitations influence downstream manufacturability and dose consistency for one-and-done therapies, such as SCD treatments?

SH: SCD gene therapies have persistently struggled with yield issues, with insufficient recovery of CD34+ cells preventing the production of viable doses and limiting commercial launches

CD34+ cells in SCD gene therapy

CD34+ is a marker for hematopoietic stem cells, which serve as the foundation for SCD gene therapies. These cells are targeted for isolation during manufacturing.

Yield can be directly related to the chosen separation methodology, so it is imperative to choose techniques with high efficiencies that leave behind minimal-to-no residuals. This helps to reduce the amplification of inefficiencies downstream, such as requiring a long expansion period due to the low number of selected cells.

In cases where a patient’s life depends on the successful manufacturing of a single treatment, failure can pose a danger to the patient, lead to tremendous expense, and result in valuable time lost. 

IH: Looking ahead, what do you believe next-generation cell separation technologies must deliver to support consistency and scalability across cell therapies?

SH: A few things are required. Firstly, technology must be gentle and preserve the target cell population’s functionality. Given the limitations of existing technologies, a biocompatible approach that leaves no magnetic residuals could help preserve the viability and functionality of targeted cell populations.

Secondly, as an industry, we need to develop cell therapy manufacturing processes that allow us to treat more patients. This can only be achieved by streamlining the process and making it cost-effective. Having a single, scalable separation technology that can be used for positive, negative, and sequential cell selection could be key to enabling the enrichment of complex cell phenotypes. It could help researchers to fine-tune their workflows at the early process development stage and provide greater flexibility and scalability.

Finally, next-generation cell separation technologies must be compatible with closed, automated Good Manufacturing Practice workflows, aligning with industry-wide movements toward digitalization and containment.

Da:

https://www.technologynetworks.com/genomics/articles/bottlenecks-in-cell-and-gene-therapy-steps-that-separate-patients-from-treatment-413699