La somministrazione inalatoria di tRNA soppressore ripristina la funzione genica nei modelli di fibrosi cistica. / Inhaled Suppressor tRNA Restores Gene Function in Cystic Fibrosis Models

La somministrazione inalatoria di tRNA soppressore ripristina la funzione genica nei modelli di fibrosi cistica. / Inhaled Suppressor tRNA Restores Gene Function in Cystic Fibrosis Models

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

I ricercatori dell'Università di Toronto hanno sviluppato una strategia terapeutica a base di RNA di nuova generazione che potrebbe potenzialmente trattare un'ampia gamma di malattie genetiche che condividono determinati tipi di mutazioni patogene. Il GRUPPO ha dimostrato che i tRNA soppressori (sup-tRNA) potenziati chimicamente, combinati con un sistema di somministrazione mirato ai polmoni, possono ripristinare la produzione di una proteina fondamentale in modelli di fibrosi cistica (FC) causata da "mutazioni nonsenso".

Queste mutazioni introducono un segnale di arresto prematuro nelle istruzioni genetiche per la produzione di una proteina. Il risultato è che le cellule possono produrre poca o nessuna proteina funzionale a lunghezza intera, compromettendo funzioni vitali in modi difficili da trattare.

I ricercatori, guidati da Bowen Li, PhD, professore associato presso la Leslie Dan Faculty of Pharmacy dell'Università di Toronto, hanno modificato geneticamente i sup-tRNA per aiutare le cellule a superare i segnali di stop prematuri introdotti da mutazioni nonsenso negli mRNA ed a completare la produzione di proteine ​​a lunghezza intera che altrimenti risulterebbero troncate od assenti. Hanno testato l'approccio su cellule epiteliali bronchiali, modelli murini e organoidi derivati ​​da pazienti affetti da fibrosi cistica, scoprendo che le modifiche chimiche aumentavano la lettura dei codoni di terminazione prematuri e l'aminoacilazione dei tRNA, prolungavano l'attività funzionale dei tRNA e riducevano l'attivazione dell'immunità innata. Inoltre, l'approccio ha ripristinato la produzione e la funzione della proteina CFTR in modelli cellulari, animali e di organoidi derivati ​​da pazienti. I ricercatori hanno anche scoperto che l'approccio può essere combinato con i farmaci esistenti per la fibrosi cistica, suggerendo la possibilità di una terapia combinata.

Li, che è anche ricercatore affiliato presso il Princess Margaret Cancer Centre dell'University Health Network, suggerisce che la ricerca potrebbe gettare le basi per una nuova classe di farmaci progettati per trattare una vasta gamma di malattie genetiche attraverso una strategia terapeutica comune. "Esistono così tanti tipi di mutazioni che causano malattie, molte delle quali colpiscono solo un piccolo numero di persone, che sviluppare una terapia genica separata per ogni singola mutazione è estremamente difficile. Con le terapie a base di tRNA, il nostro obiettivo è sviluppare un approccio terapeutico comune che potrebbe potenzialmente affrontare lo stesso tipo di mutazione in molti geni e malattie diversi, comprese le patologie rare per le quali attualmente esistono poche o nessuna opzione terapeutica efficace."

Li, autore senior e co-corrispondente, ed i suoi colleghi hanno pubblicato i risultati del loro studio su Science , in un articolo intitolato " La somministrazione non virale di tRNA chimicamente modificato salva le mutazioni nonsenso nella fibrosi cistica ", concludendo: "Questi risultati forniscono spunti ingegneristici ampiamente applicabili per il futuro sviluppo di farmaci basati sul tRNA".

Le mutazioni nonsenso introducono codoni di terminazione prematura (PTC) nell'RNA messaggero, causando l'arresto precoce della produzione proteica nelle cellule, spesso con conseguente produzione di proteine ​​troncate e non funzionali. Poiché queste mutazioni sono responsabili di circa l'11% delle malattie genetiche umane, vi è un notevole interesse nello sviluppo di terapie in grado di ripristinare la produzione di proteine ​​a lunghezza intera. Tuttavia, gli autori scrivono: "Le attuali strategie terapeutiche rimangono limitate: gli approcci di editing genetico possono presentare problematiche legate alla somministrazione, all'immunogenicità ed agli effetti fuori bersaglio, mentre gli agenti farmacologici di readthrough hanno mostrato un'efficacia limitata o una tossicità considerevole".

I tRNA soppressori (sup-tRNA) rappresentano un approccio promettente. Modificando i loro anticodoni per riconoscere i codoni di stop prematuri, i sup-tRNA ingegnerizzati possono inserire l'amminoacido appropriato e consentire alla cellula di riprendere la traduzione di proteine ​​complete e funzionali. Tuttavia, il potenziale clinico dei sup-tRNA è stato limitato da un'inefficace lettura del codone di stop, dall'immunogenicità e dalla difficoltà di somministrarli all'organismo.

Per affrontare questo problema, i ricercatori hanno modificato chimicamente i sup-tRNA e ingegnerizzato nanoparticelle lipidiche (LNP) per la somministrazione nei polmoni tramite inalazione, cercando di verificare se fossero in grado di riparare le mutazioni nonsenso nel gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ), responsabile della fibrosi cistica. "La collaborazione interdisciplinare è stata fondamentale per questo progetto", afferma la co-autrice senior Haissi Cui, PhD, professoressa assistente di chimica presso la Facoltà di Arti e Scienze. "Abbiamo utilizzato la natura come guida progettuale e scoperto che l'aggiunta di una specifica modifica rendeva il tRNA ingegnerizzato più attivo e duraturo. Questo dimostra cosa diventa possibile quando la chimica e la biologia dell'RNA si uniscono".

Jingan (Charles) Chen, ricercatore nel laboratorio di Li e coautore principale dello studio, ha osservato che un'altra sfida era quella di far arrivare i tRNA alle cellule che ne avevano bisogno. Il gruppo ha optato per le nanoparticelle lipidiche, progettate appositamente per veicolare i tRNA. "Non importa quanto potenti siano i tRNA, senza un sistema di rilascio non possono essere un farmaco", ha affermato Chen, dottorando presso la Leslie Dan Faculty of Pharmacy e l'Institute of Biomedical Engineering. "Questo sistema di rilascio specifico per il carico è uno dei principali progressi del nostro studio. Abbiamo utilizzato un sistema di rilascio di nanoparticelle lipidiche su misura, sviluppato specificamente per i tRNA."

Negli ultimi anni, la cura della fibrosi cistica è stata rivoluzionata dai modulatori del CFTR, come Trikafta. Tuttavia, questi farmaci non sono efficaci per circa un paziente su dieci la cui malattia deriva da una mutazione nonsenso. La fibrosi cistica rende le cellule incapaci di trasportare sali e acqua, causando l'accumulo di muco nelle vie respiratorie e nell'intestino. I modulatori riparano ed attivano la proteina CFTR malformata che controlla questo flusso. Ma non possono riparare ciò che non è mai stato costruito.

I ricercatori dell'Università di Toronto si sono proposti di verificare se i sup-tRNA potessero cambiare la situazione. "Abbiamo utilizzato la fibrosi cistica (FC) come modello di malattia per valutare l'efficacia terapeutica di questa piattaforma sup-tRNA, poiché le mutazioni nonsenso nel gene CFTR (regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica ) rappresentano un'esigenza clinica insoddisfatta", hanno affermato. La questione non era solo se la proteina CFTR ricomparisse, ma se fosse attiva. Attraverso i loro studi, il gruppo ha dimostrato che nelle cellule delle vie aeree umane con due comuni mutazioni nonsenso, la proteina tornava a funzionare come previsto, rimanendo presente per più di 40 giorni. Ulteriori test preclinici hanno confermato questa ipotesi.

I membri del gruppo di ricerca Jim Hu, PhD, e Tanja Gonska, PhD, entrambi scienziati del SickKids con incarichi presso la Facoltà di Medicina Temerty dell'Università di Toronto, hanno fornito l'accesso a campioni di tessuto prelevati da un paziente affetto da fibrosi cistica con un genotipo CFTR complesso , contenente quattro mutazioni – due delle quali non senso – che rendevano il paziente insensibile ai farmaci esistenti. Questi campioni sono stati coltivati ​​in modelli di organoidi in miniatura. I test hanno dimostrato che, sebbene né il sup-tRNA modificato né Trikafta avessero un effetto significativo da soli, le cellule del paziente rispondevano quando i due venivano utilizzati insieme. Il tRNA ripristinava la produzione della proteina a lunghezza intera e forniva a Trikafta un substrato su cui agire.

"In particolare, in un modello di organoide derivato da un paziente con un genotipo complesso, il trattamento combinato con sup-tRNA modificati e Trikafta ha permesso il ripristino funzionale del CFTR", hanno osservato in sintesi. "In questo contesto, i sup-tRNA hanno soppresso le mutazioni nonsenso per ripristinare la sintesi del CFTR a lunghezza intera, mentre il Trikafta ha supportato il ripiegamento, il trasporto e l'attività del CFTR... Questo risultato ha dimostrato un approccio terapeutico complementare promettente e ha evidenziato l'importanza di combinare le terapie per ripristinare i genotipi complessi del CFTR ."

Secondo i ricercatori, lo studio rappresenta un importante passo avanti nel dimostrare le potenzialità terapeutiche del tRNA. Il laboratorio di Li punta ad estendere l'approccio ad altri organi, ognuno dei quali richiederà un sistema di somministrazione specifico. Per quanto riguarda i polmoni, il gruppo ha dimostrato che le particelle possono sopravvivere alla trasformazione in una finissima nebulizzazione, un primo passo verso un trattamento che i pazienti potrebbero inalare a casa.

"Lo stesso tipo di segnale di stop prematuro può verificarsi in molti geni diversi, causando malattie che colpiscono polmoni, cervello, muscoli ed altri tessuti", ha affermato Li. "Il nostro obiettivo a lungo termine è sviluppare farmaci a base di tRNA che riconoscano questi segnali di stop comuni, in modo che una singola strategia terapeutica possa essere potenzialmente applicata a molte diverse malattie genetiche."

In una prospettiva correlata , Jacob W. Myerson, PhD, e Drew Weissman, PhD, della Perelman School of Medicine dell'Università della Pennsylvania, hanno commentato: "I risultati di Chen et al. hanno implicazioni per migliaia di pazienti affetti da fibrosi cistica". Myerson e Weissman osservano che la trasposizione degli effetti riportati negli studi preclinici dei ricercatori al miglioramento della funzione respiratoria nei pazienti con fibrosi cistica richiederà ulteriore lavoro, compresa la caratterizzazione degli effetti collaterali. Suggeriscono che "... un probabile regime terapeutico potrebbe includere sia il tRNA per ripristinare l'espressione aberrante del CFTR sia farmaci per potenziare la normale funzione del CFTR, una combinazione che potrebbe avere un profilo di effetti collaterali aggiuntivo. Esplorare il potenziale terapeutico del tRNA, dei farmaci e delle nanoparticelle lipidiche potrebbe ancora richiedere un ripensamento sia del carico che del vettore".

ENGLISH

Researchers at the University of Toronto have developed a next-generation RNA therapeutic strategy that could have the potential to treat a wide range of genetic diseases that share certain types of disease-causing mutations. The team showed that chemically enhanced suppressor transfer RNAs (sup-tRNAs) combined with a lung-targeted delivery system can restore production of a critical protein in models of cystic fibrosis (CF) caused by “nonsense mutations.”

These mutations introduce a premature stop signal into the genetic instructions for making a protein. The result is that cells may produce little or no full-length functional protein, disrupting vital functions in ways that are difficult to treat.

The researchers, led by Bowen Li, PhD, an associate professor in U of T’s Leslie Dan Faculty of Pharmacy, engineered sup-tRNAs to help cells read through these premature stop signals introduced by nonsense mutations into the mRNAs, and complete production of full-length proteins that would otherwise be truncated or absent.  They tested the approach in bronchial epithelial cells, mouse models, and patient-derived cystic fibrosis organoids and found that the chemical modifications increased the readthrough of premature termination codons and tRNA aminoacylation, prolonged the tRNAs’ functional activity, and reduced innate immune activation. Moreover, the approach restored CFTR protein production and function across cell, animal, and patient-derived organoid models. The researchers also found that the approach can be combined with existing cystic fibrosis drugs, suggesting the potential for combination therapy.

Li, who is also an affiliate scientist at the University Health Network’s Princess Margaret Cancer Centre, suggests that the research could lay the foundation for a new class of drugs designed to treat a swath of genetic diseases through a common therapeutic strategy. “There are so many types of disease-causing mutations—many affecting only a small number of people—that developing a separate gene therapy for every individual mutation is extremely challenging. With tRNA therapeutics, our goal is to develop a common therapeutic approach that could potentially address the same type of mutation across many different genes and diseases, including rare conditions that currently have few or no effective treatment options.”

Senior and co-corresponding author Li, and colleagues reported on their study in Science, in a paper titled “Nonviral delivery of chemically modified tRNA rescues nonsense mutations in cystic fibrosis,” concluding “These findings provide broadly applicable engineering insights for the future development of tRNA-based medicines.”

Nonsense mutations introduce premature termination codons (PTCs) in messenger RNA, causing protein production in cells to halt early, often resulting in truncated, nonfunctional proteins. Because these mutations account for ~11% of human genetic disorders, there is considerable interest in developing therapies that can restore production of full-length proteins. However, the authors wrote, “Current therapeutic strategies remain limited: Gene-editing approaches can face challenges related to delivery, immunogenicity, and off-target effects, whereas pharmacological readthrough agents have shown limited efficacy or considerable toxicity.”

Suppressor tRNAs (sup-tRNAs) offer a promising approach. By modifying their anticodons to recognize premature stop codons, engineered sup-tRNAs can insert the appropriate amino acid and allow the cell to resume translation of full-length, functional proteins. Yet the clinical potential of sup-tRNAs has been constrained by inefficient readthrough, immunogenicity, and difficulty in delivering them into the body.

To address this, the researchers chemically modified sup-tRNAs and engineered lipid nanoparticles (LNPs) for delivery into the lungs via inhalation, looking to see if they could repair the nonsense mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene responsible for cystic fibrosis. “Interdisciplinary collaboration was key to this project,” says co-senior author Haissi Cui, PhD, assistant professor of chemistry in the Faculty of Arts & Science. “We used nature as our design guide and found that adding one specific modification made the engineered tRNA more active and longer lasting. It shows what becomes possible when chemistry and RNA biology come together.”

Jingan (Charles) Chen, a researcher in Li’s lab and co-lead author of the study, noted that another challenge was getting the tRNAs to the cells that needed them. The team settled on lipid nanoparticles, which they designed to deliver tRNA. “No matter how powerful you make those tRNAs, without delivery, they cannot be a drug,” said Chen, a PhD candidate in the Leslie Dan Faculty of Pharmacy and the Institute of Biomedical Engineering. “That cargo-specific delivery system is one of the major advances of our study. We used a tailored lipid nanoparticle delivery system that is specifically developed for tRNA.”

In recent years, cystic fibrosis care has been transformed by CFTR modulators, such as Trikafta. But such drugs are not effective for the roughly one in 10 patients whose disease stems from a nonsense mutation. Cystic fibrosis leaves cells unable to move salt and water, so mucus clogs the airways and gut. Modulators repair and activate the misshapen CFTR protein that controls this flow. But they can’t fix what was never built.

The U of T researchers set out to test if the sup-tRNAs could change that. “We used cystic fibrosis (CF) as a disease model to evaluate the therapeutic efficacy of this sup-tRNA platform because nonsense mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene represent an unmet clinical need,” they stated. The question was not just whether the CFTR protein reappeared, but whether it was active. Through their studies the team showed that in human airway cells with two common nonsense mutations, the protein came back and worked as it should, sticking around for more than 40 days. Further preclinical tests pointed in the same direction.

Research team members Jim Hu, PhD, and Tanja Gonska, PhD, both SickKids scientists with appointments in U of T’s Temerty Faculty of Medicine, provided access to tissue from a cystic fibrosis patient with a complex CFTR genotype containing four mutations—two of them nonsense—that left the the patient unresponsive to existing drugs. These samples were grown into miniature organoid models. Test showed that while neither the modified sup-tRNA nor Trikafta did much on its own, the patient’s cells responded when the two were used together. The tRNA restored production of the full-length protein and gave Trikafta something to work with.

“Notably, in a patient-derived organoid model with a complex genotype, cotreatment with modified sup-tRNAs and Trikafta enabled functional rescue of CFTR,” they noted in summary. “In this setting, sup-tRNAs suppressed the nonsense mutations to restore full-length CFTR synthesis, whereas Trikafta supported the folding, trafficking, and activity of CFTR … This finding showcased a promising complementary therapeutic approach and highlighted the importance of combining therapies to rescue complex CFTR genotypes.”

The researchers say the study represents a major step forward in demonstrating tRNA’s therapeutic promise. Li’s lab is looking to expand the approach to other organs, each of which will need a specialized delivery system. For the lungs, the team has shown its particles can survive being turned into a fine mist—a first step toward a treatment that patients could inhale at home.

“The same type of premature stop signal can occur in many different genes, causing diseases that affect the lungs, brain, muscles and other tissues,” said Li. “Our long-term goal is to develop tRNA medicines that recognize these shared stop signals, so that one therapeutic strategy could potentially be applied across many different genetic diseases.”

In a related perspective, Jacob W. Myerson, PhD, and Drew Weissman, PhD, at Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, commented, “The results of Chen et al. have implications for thousands of cystic fibrosis patients.” Myerson and Weissman note that translating the effects reported in the researchers’ preclinical studies to amelioration of respiratory function in cystic fibrosis patients will further work, including characterizing side effects. They suggest that “… a likely therapeutic regimen could include both tRNA to rescue aberrant CFTR expression and drugs to enhance normal CFTR function, a combination that might have an additional side effect profile. Navigating the therapeutic potential of the tRNA, drugs, and LNPs may still be a matter of rethinking both the cargo and the carrier.”

Da:

https://www.genengnews.com/topics/drug-discovery/inhaled-suppressor-trna-restores-gene-function-in-cystic-fibrosis-models/?_hsenc=p2ANqtz-9JZkWHpobPSsYkNRRIdm8pFR9h_coTpS5kxtjVmniJkmjbO0N6ZqVsyGB-rL4TcTOgBwSb9WpQWxEEkebyIsCawuSu4DiV_sBPQlDkAxCUhkyi02I&_hsmi=435751914