La struttura e la sincronia dei canali del calcio nelle cellule muscolari potrebbero favorire lo sviluppo di terapie per le malattie muscolari. / Muscle Cell Calcium Channel Structure, Synchronicity Could Advance Muscle Disease Therapeutics

La struttura e la sincronia dei canali del calcio nelle cellule muscolari potrebbero favorire lo sviluppo di terapie per le malattie muscolari. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questo tipo di applicazione. / Muscle Cell Calcium Channel Structure, Synchronicity Could Advance Muscle Disease Therapeutics. The ENEA patent procedure RM2012A000637 is very useful in this type of application.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Ogni passo che compiamo inizia con un'ondata di calcio all'interno delle nostre cellule muscolari, che ne provoca la contrazione. Utilizzando la microscopia crioelettronica (cryo-EM), i ricercatori del Centro Max Delbrück hanno rivelato come i canali del calcio delle cellule muscolari, noti come recettori della rianodina di tipo 1 (RyR1), si aprano sincronicamente. Il gruppo, guidato da Vasilii Mikirtumov, PhD, ex dottorando nel laboratorio di biologia strutturale in situ di Misha Kudryashev, PhD, suggerisce che le loro scoperte potrebbero spiegare un meccanismo alla base di gravi malattie muscolari e potenzialmente indicare bersagli terapeutici.

Kudryashev è l'autore senior e corrispondente dell'articolo scientifico pubblicato su Nature Communications , intitolato " Attivazione di RyR1 indotta da ligandi nelle membrane native ", in cui gli autori concludono che le loro scoperte "...spiegano il meccanismo di attivazione di RyR1 mediata da ligandi nelle membrane native e forniscono informazioni strutturali fondamentali per la comprensione delle malattie del muscolo scheletrico associate a RyR1 e per lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate".

La contrazione del muscolo scheletrico si basa su "...una precisa interazione tra segnali elettrici e rilascio di Ca2+ dai depositi interni", hanno spiegato gli autori. Mantenendosi pronte alla contrazione, le cellule mantengono il calcio bloccato in questo compartimento interno, il reticolo sarcoplasmatico (RS). La sua membrana è costellata da migliaia di canali RyR1, i più grandi canali ionici conosciuti, che contengono pori da cui viene rilasciato il calcio.

Affinché un muscolo si contragga correttamente, i canali RyR1 devono aprirsi sincronicamente tramite un meccanismo noto come "gating accoppiato". Il modo in cui ciò avvenga non è chiaro da quando è stato descritto per la prima volta quasi 30 anni fa. "...il meccanismo fisico che orchestra questa cooperatività è rimasto sconosciuto", hanno osservato gli autori nel loro articolo.

Attraverso i loro studi, Mikirtumov, Kudryashev e colleghi hanno ottenuto le prime immagini 3D ad alta risoluzione di RyR1 in sei diverse fasi di apertura all'interno della membrana intatta del reticolo sarcoplasmatico. La struttura di RyR1 era già stata descritta in precedenza, ma gli studi precedenti avevano utilizzato canali che erano stati rimossi dalla membrana. Il laboratorio di Kudryashev, invece, ha studiato la struttura di RyR1 nel suo ambiente naturale utilizzando tecniche di imaging avanzate come la crio-microscopia elettronica e la tomografia. "Poiché RyR1 è una proteina di membrana, è necessario estrarla con detergenti per purificarla. Ma questo ambiente può essere dannoso per una proteina così sensibile", ha spiegato Mikirtumov, ora ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Christian Spahn presso la Charité – Universitätsmedizin Berlin. "Volevamo catturare la struttura del canale nella sua membrana nativa e scoprire se il suo meccanismo di apertura appare diverso in tale ambiente".

Il gruppo ha isolato il reticolo sarcoplasmatico (SR) dal muscolo di coniglio e lo ha analizzato mediante microscopia crioelettronica presso la Core Facility for Cryo-Electron Microscopy, gestita congiuntamente da Charité – Universitätsmedizin Berlin, dal Max Delbrück Center e dal Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP). Il laboratorio di Kudryashev possiede competenze specialistiche in crio-microscopia elettronica e tomografia, nonché gli strumenti computazionali necessari per analizzare i dati ottenuti.

"Facciamo passare degli elettroni attraverso il campione e scattiamo migliaia di foto, ognuna con molte copie della stessa proteina", ha spiegato Mikirtumov. "Poi ne calcoliamo la media, ottenendo così una ricostruzione 3D ad alta risoluzione."

Aggiungendo piccole molecole per avviare l'apertura del canale, i ricercatori hanno osservato RyR1 in sei fasi intermedie tra la chiusura completa e l'apertura completa. "Il confronto delle strutture ha rivelato il movimento di apertura completa: la parte esterna voluminosa ruota all'interno del piano della membrana, come ruotare l'anello di un obiettivo fotografico, mentre il poro nel canale si allarga fino a circa il doppio della sua larghezza originale.

Le immagini risultanti hanno mostrato che i canali adiacenti rimangono in contatto tra loro durante la transizione dallo stato chiuso a quello aperto. Questo contatto, od interfaccia, media il gating accoppiato: quando un canale ruota aprendosi, esercita una tensione sull'interfaccia con il canale adiacente, facilitando la rotazione e l'apertura anche di quest'ultimo. "È come gli ingranaggi di un orologio", ha affermato Kudryashev. "Una volta che un ingranaggio gira, predispone anche i vicini a girare".

Nel loro articolo, il gruppo ha scritto in sintesi: "Le strutture di RyR1 in quattro distinti stati funzionali, nonché in due stati intermedi indotti da ligandi attivatori, hanno mostrato che l'attivazione di RyR1 include un'ampia componente di rotazione nel piano della membrana. Le strutture rivelano contatti fisici diretti, angolo ad angolo, tra i recettori, fornendo una visione ad alta risoluzione dell'interfaccia che media il gating accoppiato."

Utilizzando la tomografia crioelettronica, il gruppo ha anche visualizzato coppie di canali adiacenti in cinque diverse fasi di apertura. Hanno scoperto che i canali adiacenti avevano maggiori probabilità di essere sincronizzati e che due canali chiusi interagenti erano più stabili di due canali chiusi isolati. Questi risultati supportano l'ipotesi di un gating accoppiato e suggeriscono che i canali si mantengano chiusi a vicenda.

Le mutazioni del gene RYR1 causano ipertermia maligna, una reazione potenzialmente letale ad alcuni anestetici, e miopatie congenite che indeboliscono i muscoli. Molte di queste mutazioni alterano il canale proprio nel punto in cui entra in contatto con il canale adiacente.

Mikirtumov ha aggiunto: "Molte di queste mutazioni non sembrano influenzare il modo in cui un singolo canale si apre, ma piuttosto il modo in cui i canali cooperano con quelli vicini. Ne abbiamo mappate diverse sull'interfaccia e pensiamo che in questi casi sia proprio la cooperazione tra i canali a interrompersi."

I ricercatori ipotizzano che un'alterazione all'interfaccia tra i canali li renda permeabili, rilasciando calcio quando dovrebbero trattenerlo. Questo rende l'interfaccia stessa un bersaglio per le terapie. "Proponiamo un meccanismo per l'attivazione di RyR1, spostando l'attenzione da un singolo evento del canale ad un processo cooperativo orchestrato da un reticolo di recettori accoppiati meccanicamente", hanno affermato.

Il gruppo sta già testando l'idea. "Dobbiamo impedire che i canali si aprano spontaneamente", ha affermato Kudryashev. "Ora che sappiamo come è organizzato lo stato inattivo, possiamo progettare farmaci biologici o piccole molecole per stabilizzare questo stato chiuso". Gli autori hanno concluso: "Questi risultati sottolineano l'importanza fisiologica degli array di RyR1 come unità funzionali integrate e forniscono nuove prospettive sull'accoppiamento eccitazione-contrazione e sullo sviluppo di terapie mirate per le canalopatie legate a RyR1".

ENGLISH

Every step we take begins with a burst of calcium inside our muscle cells, causing them to contract. Using cryo-electron microscopy (cryo-EM), researchers at the Max Delbrück Center have revealed how muscle cell calcium channels, known as type-1 ryanodine receptors (RyR1), open synchronously. The team, led by Vasilii Mikirtumov, PhD, a former doctoral student in the in situ structural biology lab of Misha Kudryashev, PhD, suggests that their findings may explain a mechanism behind serious muscle diseases and potentially point to therapeutic targets.

Kudryashev is senior and corresponding author of the scientists’ published paper in Nature Communications, titled “Ligand-induced activation of RyR1 in native membranes,” in which they conclude that their findings “… explain the mechanism of ligand-gated activation of RyR1 in native membranes and provide structural insights critical for understanding RyR1-associated skeletal muscle diseases and developing targeted therapeutic strategies.”

Skeletal muscle contraction relies on “… a precise interplay between electrical signals and Ca2+ release from internal stores,” the authors explained. Maintaining readiness for contraction, the cells keep calcium locked in this internal compartment, the sarcoplasmic reticulum (SR). Studding its membrane are thousands of RyR1 channels—the largest known ion channels—containing pores that release calcium.

For a muscle to contract properly, RyR1 channels must open synchronously via a mechanism known as “coupled gating.” How they accomplish this has been unclear since it was described almost 30 years ago. “…  the physical mechanism orchestrating this cooperativity has remained unknown,” the authors noted in their paper.

Through their reported studies Mikirtumov, Kudryashev, and colleagues have captured the first high-resolution 3D images of RyR1 at six stages of opening inside the intact sarcoplasmic reticulum membrane. The structure of RyR1 has been described before, but previous studies used channels that had been removed from the membrane. Instead, the Kudryashev lab studied the structure of RyR1 in its natural environment using the advanced imaging techniques of cryo-EM and tomography. “Because RyR1 is a membrane protein, you have to pull it out with detergents to purify it. But that environment can be disruptive to such a sensitive protein,” explained Mikirtumov, who is now a postdoctoral researcher in the lab of Christian Spahn at Charité – Universitätsmedizin Berlin. “We wanted to capture the structure of the channel in its native membrane and find out whether its opening mechanism looks different there.”

The team isolated the SR from rabbit muscle and imaged it at the Core Facility for Cryo-Electron Microscopy, which is run jointly by Charité – Universitätsmedizin Berlin, the Max Delbrück Center, and the Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP). The Kudryashev lab has specialized expertise in cryo-EM and tomography and the computational tools necessary to analyze the resulting data.

“We shoot electrons through the sample and take thousands of pictures, each with many copies of the same protein,” explained Mikirtumov. “Then we average them all together, and that gives us a high-resolution 3D reconstruction.”

By adding small molecules to initiate channel opening, the researchers caught RyR1 at six stages between fully closed and fully open. “Comparing the structures revealed the full opening motion: The bulky outer part rotates within the plane of the membrane, like turning the ring of a camera lens, while the pore in the channel widens to roughly twice its original width.

The resulting images showed that neighboring channels remain in contact with each other when transitioning from the closed to open states. This contact, or interface, mediates coupled gating: as one channel rotates open, it strains the interface with its neighbor, making it easier for that channel to rotate and open too. “It’s like the cogs in a clock,” said Kudryashev. “Once one cog turns, it primes its neighbors to turn, too.”

In their paper the team wrote in summary, “The RyR1 structures in four distinct as well as two intermediate functional states induced by activating ligands showed that the activation of RyR1 includes a large rotation component in the membrane plane. The structures reveal direct, corner-to-corner physical contacts between receptors, providing a high-resolution view of the interface that mediates coupled gating.”

Using cryo-electron tomography, the team also imaged pairs of neighboring channels at five stages of opening. They found neighboring channels were more likely to be synchronized, and that two interacting closed channels were more stable than two closed channels in isolation. These findings support coupled gating and suggest that channels hold each other shut.

The team isolated the SR from rabbit muscle and imaged it at the Core Facility for Cryo-Electron Microscopy, which is run jointly by Charité – Universitätsmedizin Berlin, the Max Delbrück Center, and the Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie (FMP). The Kudryashev lab has specialized expertise in cryo-EM and tomography and the computational tools necessary to analyze the resulting data.

“We shoot electrons through the sample and take thousands of pictures, each with many copies of the same protein,” explained Mikirtumov. “Then we average them all together, and that gives us a high-resolution 3D reconstruction.”

By adding small molecules to initiate channel opening, the researchers caught RyR1 at six stages between fully closed and fully open. “Comparing the structures revealed the full opening motion: The bulky outer part rotates within the plane of the membrane, like turning the ring of a camera lens, while the pore in the channel widens to roughly twice its original width.

The resulting images showed that neighboring channels remain in contact with each other when transitioning from the closed to open states. This contact, or interface, mediates coupled gating: as one channel rotates open, it strains the interface with its neighbor, making it easier for that channel to rotate and open too. “It’s like the cogs in a clock,” said Kudryashev. “Once one cog turns, it primes its neighbors to turn, too.”

In their paper the team wrote in summary, “The RyR1 structures in four distinct as well as two intermediate functional states induced by activating ligands showed that the activation of RyR1 includes a large rotation component in the membrane plane. The structures reveal direct, corner-to-corner physical contacts between receptors, providing a high-resolution view of the interface that mediates coupled gating.”

Using cryo-electron tomography, the team also imaged pairs of neighboring channels at five stages of opening. They found neighboring channels were more likely to be synchronized, and that two interacting closed channels were more stable than two closed channels in isolation. These findings support coupled gating and suggest that channels hold each other shut.

Mutations in the RYR1 gene cause malignant hyperthermia, a life-threatening reaction to some anesthetics, and congenital myopathies that weaken muscles. Many of these mutations alter the channel exactly where it touches its neighbor.

Mikirtumov added, “A lot of these mutations don’t seem to affect how a single channel opens, but rather how channels cooperate with their neighbors. We mapped several of them onto the interface, and we think that in these cases, it’s the cooperation between channels that breaks down.”

The researchers propose that disruption at the interface between channels makes them leaky, releasing calcium when they should retain it. This makes the interface itself a target for therapies. “We propose a mechanism for RyR1 activation, shifting the focus from an individual channel event to a cooperative process orchestrated by a mechanically coupled receptor lattice,” they stated.

The team is already testing the idea. “We need to prevent the channels from opening spontaneously,” said Kudryashev. “Now that we know how the inactive state is organized, we can design biologics or small molecules to stabilize this closed state.” The authors concluded, “These results emphasize the physiological importance of RyR1 arrays as integrated functional units and provide new perspectives on EC-coupling and the development of targeted therapeutics for RyR1-linked channelopathies.”

Da:

https://www.genengnews.com/topics/translational-medicine/muscle-cell-calcium-channel-structure-synchronicity-could-advance-muscle-disease-therapeutics/