La proteomica mappa i mitocondri di Acanthamoeba, agente infettivo degli occhi, in relazione ai livelli di ossigeno. / Proteomics Maps Eye-Infecting Acanthamoeba Mitochondria Across Oxygen Levels

 La proteomica mappa i mitocondri di Acanthamoeba, agente infettivo degli occhi, in relazione ai livelli di ossigeno. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questo tipo di applicazione. / Proteomics Maps Eye-Infecting Acanthamoeba Mitochondria Across Oxygen Levels. The process of ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this type of application.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Se l'Acanthamoeba viene privata dell'ossigeno, i suoi mitocondri non si spengono semplicemente. Al contrario, gli organelli riorganizzano il loro meccanismo di produzione di energia, consentendo all'ameba di generare idrogeno gassoso. L'Acanthamoeba è un organismo unicellulare a vita libera che si trova in acqua, suolo ed aria. Sebbene raramente causi malattie, può infettare la cornea e provocare cheratite che mette a rischio la vista; la sua flessibilità metabolica potrebbe aiutarla a persistere in questo ambiente.

Questa capacità di adattamento è una delle diverse strategie di difesa che rendono le infezioni da Acanthamoeba difficili da eliminare. Il patogeno può anche rifugiarsi in una cisti resistente ai farmaci ed i trattamenti disponibili una volta diagnosticata l'infezione sono limitati e possono danneggiare le cellule umane. Mappando le proteine ​​mitocondriali dell'organismo, i ricercatori dispongono ora di un nuovo metodo per studiare i meccanismi alla base della sua sopravvivenza ed individuare bersagli terapeutici più selettivi.

"È una grande sfida. La mancanza di strumenti diagnostici facilmente accessibili è un problema, e anche dopo aver finalmente ottenuto una diagnosi, non disponiamo di farmaci efficaci", ha affermato Jon Stefely, MD, PhD, ricercatore nel campo del metabolismo presso il Morgridge Institute for Research e professore assistente di chimica biomolecolare presso la Facoltà di Medicina e Sanità Pubblica dell'Università del Wisconsin. "I farmaci attualmente disponibili non sono mirati e sono tossici, ed abbiamo semplicemente bisogno di più opzioni per il trattamento di queste infezioni."

Per iniziare ad ampliare queste opzioni, Stefely ed i suoi colleghi hanno creato un inventario ad alta affidabilità delle proteine ​​che operano all'interno dei mitocondri di Acanthamoeba castellanii. Il mitoproteoma definito sperimentalmente rivela la flessibilità metabolica del patogeno, evidenziando al contempo potenziali vulnerabilità terapeutiche. Il loro articolo, " Il proteoma mitocondriale di Acanthamoeba delinea i percorsi aerobici e anaerobici regolati dinamicamente dall'ossigeno ", è stato pubblicato su Cell come parte del consorzio MitoCarta Tree of Life, insieme al loro altro articolo pubblicato su Cell Press Blue, " La riannotazione del genoma di Acanthamoeba castellanii e la profilazione multiomica dell'incistamento rivelano proteine ​​della parete cistica ed enzimi attivi sui carboidrati ". Il consorzio è stato ideato da Vamsi Mootha, MD, del Broad Institute, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School e Howard Hughes Medical Institute; Stefely ha completato il lavoro come ricercatore post-dottorato nel laboratorio di Mootha.

Nel loro articolo pubblicato su Cell, i ricercatori hanno innanzitutto migliorato l'annotazione del genoma nucleare dell'organismo – un aspetto importante perché la maggior parte delle proteine ​​mitocondriali sono codificate nel nucleo – portando la precisione dal 52% circa al 98% utilizzando il sequenziamento dell'RNA a lettura lunga ed altri metodi empirici. "Se immaginate una pagina di parole in un libro, sarebbe come se tutte le parole fossero schiacciate insieme ed in una lingua che non conoscete", ha detto Stefely. "Dovreste chiedervi: 'Dove sono le parole? Come faccio a separare una parola dall'altra?' È difficile distinguerle."

Hanno quindi combinato l'immunoprecipitazione mitocondriale, la purificazione mediante gradiente di densità, la microscopia, la spettrometria di massa e la profilazione di correlazione proteica. Le proteine ​​che si arricchivano con l'aumentare della purezza dei campioni mitocondriali venivano assegnate all'organello. La spettrometria di massa mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide nativa blu (Blue native PAGE-MS) per la profilazione del complesso proteico ha permesso di identificare ulteriormente 20 assemblaggi macromolecolari.

Il catalogo AcMitoCarta risultante contiene 1.122 proteine, di cui 381 senza controparti facilmente identificabili nei mitocondri umani o di lievito. Poco più di 300 sono state descritte come uniche rispetto a questi organismi. Tale divergenza potrebbe essere importante per la scoperta di farmaci: un composto mirato ad una proteina od ad una via metabolica specifica di un microrganismo potrebbe avere meno probabilità di danneggiare le cellule umane. "Ciò che è stato dimostrato storicamente", ha affermato Stefely, "è che se si ha una proteina bersaglio in una via biochimica completamente unica per il microrganismo, si tratta di un bersaglio migliore rispetto a qualcosa che ha un omologo negli esseri umani".

La profilazione proteomica e trascrittomica ha inoltre dimostrato che l'ossigeno riorganizza in modo esteso il macchinario bioenergetico dell'ameba. In condizioni di elevata concentrazione di ossigeno, i suoi mitocondri utilizzano vie metaboliche aerobiche; in condizioni di anossia, inducono una via metabolica che converte il piruvato:ferredossina ossidoreduttasi in idrogenasi. I ricercatori hanno dimostrato che le cellule di Acanthamoeba derivate da infezioni oculari possono produrre idrogeno gassoso in assenza di ossigeno attraverso un'idrogenasi sensibile all'ossigeno localizzata nei mitocondri. Questo cambiamento metabolico potrebbe aiutare l'organismo a sopravvivere in nicchie ecologiche mutevoli, inclusa la cornea.

AcMitoCarta fornisce ora un quadro di riferimento per testare quali di queste proteine ​​insolite siano essenziali per la sopravvivenza delle amebe, la formazione di cisti o l'adattamento all'ossigeno. Stefely prevede di studiare i candidati ed i percorsi in gruppi mirati, con collaboratori che contribuiranno con le loro competenze in spettrometria di massa, sequenziamento dell'RNA, metabolismo, biologia strutturale ed imaging. "Un obiettivo a lungo termine è quello di annotare le funzioni per tutti questi bersagli", ha affermato, "ma li affronteremo un piccolo gruppo alla volta e c'è un grande potenziale per nuove scoperte".

Il catalogo non identifica ancora un farmaco pronto all'uso, ma restringe la ricerca a componenti e percorsi mitocondriali supportati sperimentalmente che differiscono da quelli presenti nell'uomo. Passando da un'annotazione genomica incompleta a una mappa funzionale della biologia mitocondriale responsiva all'ossigeno, il lavoro pone le basi per trattamenti più selettivi contro un'infezione la cui forma più aggressiva può resistere alle terapie attuali.

ENGLISH

Starve Acanthamoeba of oxygen, and its mitochondria do not simply shut down. Instead, the organelles retool their energy-producing machinery, enabling the amoeba to generate hydrogen gas. Acanthamoeba is a free-living, single-celled organism found in water, soil, and air. Although it rarely causes disease, it can infect the cornea and cause sight-threatening keratitis—and its metabolic flexibility may help it persist there.

That adaptability is one of several defenses that make Acanthamoeba infections difficult to eliminate. The pathogen can also retreat into a drug-resistant cyst, and the treatments available once an infection is diagnosed are limited and may damage human cells. By mapping the organism’s mitochondrial proteins, researchers now have a new way to probe the machinery behind its survival and search for more selective therapeutic targets.

“It’s a big challenge. The lack of readily available diagnostics is a problem, and then even after you finally get to the diagnosis, we don’t have good drugs,” said Jon Stefely, MD, PhD, a metabolism investigator at the Morgridge Institute for Research and assistant professor of biomolecular chemistry at the University of Wisconsin School of Medicine and Public Health. “Our current drugs are untargeted and toxic, and we just need more options for treating these infections.”

To begin expanding those options, Stefely and his colleagues created a high-confidence inventory of the proteins operating inside Acanthamoeba castellanii mitochondria. The experimentally defined mitoproteome reveals the pathogen’s metabolic flexibility while highlighting potential therapeutic vulnerabilities. Their paper, “Mitochondrial proteome of Acanthamoeba delineates aerobic and anaerobic pathways dynamically regulated by oxygen,” was published in Cell as part of the MitoCarta Tree of Life Consortium, along with their other paper published in Cell Press Blue, “Acanthamoeba castellanii genome reannotation and multiomic encystation profiling reveals cyst wall proteins and carbohydrate-active enzymes.” The consortium was conceived by Vamsi Mootha, MD, of the Broad Institute, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, and Howard Hughes Medical Institute; Stefely completed the work as a postdoctoral researcher in Mootha’s laboratory.

In their Cell paper, the researchers first improved the organism’s nuclear genome annotation—important because most mitochondrial proteins are encoded in the nucleus—from about 52% accuracy to 98% using long-read RNA sequencing and other empirical methods. “If you imagine a page of words in a book, it would be like all the words were squished together and in a language that you don’t know,” said Stefely. “You would have to ask, ‘Where are the words? How do I separate one word from the next?’ It’s hard to tease apart.”

They then combined mitochondrial immunoprecipitation, density-gradient purification, microscopy, mass spectrometry, and protein-correlation profiling. Proteins that became enriched as mitochondrial samples grew purer were assigned to the organelle. Blue native PAGE–mass spectrometry for complexome profiling further resolved 20 macromolecular assemblies.

The resulting AcMitoCarta catalog contains 1,122 proteins, including 381 without readily identifiable counterparts in human or yeast mitochondria. Just over 300 were described as unique when compared with those organisms. Such divergence could matter for drug discovery: a compound directed at a microbe-specific protein or pathway may be less likely to damage human cells. “What’s been proven historically,” Stefely said, “is that if you have a target protein in a biochemical pathway that’s completely unique to the microbe, it’s a better target than something that has a homolog in humans.”

Proteomic and transcriptomic profiling also showed that oxygen extensively rewires the amoeba’s bioenergetic machinery. Under oxygen-rich conditions, its mitochondria use aerobic pathways; under anoxia, they induce a pyruvate:ferredoxin oxidoreductase-to-hydrogenase pathway. The researchers demonstrated that eye-infection-derived Acanthamoeba cells can produce hydrogen gas without oxygen through a mitochondria-localized, oxygen-sensitive hydrogenase. That metabolic switch may help the organism persist in changing niches, including the cornea.

AcMitoCarta now provides a framework for testing which of these unusual proteins are essential to amoebal survival, cyst formation, or oxygen adaptation. Stefely plans to investigate the candidates and pathways in focused groups, with collaborators contributing expertise in mass spectrometry, RNA sequencing, metabolism, structural biology, and imaging. “A long-term goal is to annotate functions for all of those targets,” he said, “but we’ll take them one small set at a time and there is a lot of potential for new discoveries.”

The catalog does not yet identify a ready-to-use drug, but it narrows the search to experimentally supported mitochondrial components and pathways that differ from those in people. By moving from an incomplete genome annotation to a functional map of oxygen-responsive mitochondrial biology, the work lays a foundation for more selective treatments against an infection whose toughest form can withstand today’s therapies.

Da:

https://www.genengnews.com/topics/omics/proteomics-maps-eye-infecting-acanthamoeba-mitochondria-across-oxygen-levels/?_hsenc=p2ANqtz--293e2vq__JVrcDg5s2G1SEsL5f-aw2mHNnDCy-PA82bWAxrQBfyy9XzmA_4rKNtPEmroXM8zBEiabvCEqEdInQe41J4JsIJTLA9XRuKPlMmPIxSA&_hsmi=442234441