3D Analysis of Patient-Derived Tumor Organoids / Analisi 3D di organoidi tumorali derivati dal paziente

 3D Analysis of Patient-Derived Tumor Organoids. The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this application./ Analisi 3D di organoidi tumorali derivati dal paziente. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questa applicazione.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Confocal images of patient-derived tumor organoids (PDOs) were quantitatively analyzed using NoviSight™ 3D software to evaluate their morphological features and antibody binding of molecular targeted drugs.

Introduction 3D tissue models are popular for drug discovery since they mimic the in vivo microenvironment. PDOs are one of the most powerful tools to recapitulate the original patients’ drug response. In fact, a recent study reveals that phenotypic and genotypic profiling of PDOs feature a high degree of similarity to the original patient tumor. More importantly, the PDOs could predict drug reactivity with more than 80% accuracy. By using Fukushima patient-derived tumor organoids (F-PDO®), Olympus’ FLUOVIEW™ FV3000 confocal laser scanning microscope, and NoviSight™ 3D analysis software, we offer a novel workflow for studying PDO morphology and drug distribution.

Benefits

• Image and analyze PDOs while retaining the information in their 3D structure. 

• NoviSight software can identify objects in 3D, classify the objects, and deliver statistical data.

Methods

 Cell preparation

 To prepare the cells, we used three types of lung F-PDOs (RLUN5, RLUN16, and RLUN21). RLUN5 was grown from an adenosquamous carcinoma tumor while RLUN16 and RLUN21 were grown from a squamous carcinoma tumor. RLUN21 forms large cell aggregates and features a larger cytoplasm than the others (Fig. 1). The F-PDOs were then centrifuged, collected, and fixed with 4% paraformaldehyde overnight. Erbitux®, an epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor, and Herceptin®, a human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) inhibitor, were labeled with HiLyte™ Fluor 555 (Chemical Dojin) and incubated with F-PDOs for three hours.  

Immunostaining and clearing

 We performed the Hama et al. immunostaining protocol with some modification (Fig. 2). Each fixed F-PDO was incubated overnight with a Ki67 antibody (Abcam, 16667) and diluted with AbScale solution (0.33 M Urea and 0.2% Triton-X100). After washing with AbScale, the F-PDOs were incubated with a second antibody for three hours and diluted with AbScale. After washing with AbScale rinse solution for an hour, F-PDOs were refixed with 4% paraformaldehyde. Then they were washed with a phosphate-buffered saline (PBS) solution and incubated overnight using the clearing reagent ScaleS4 with DAPI. The cleared F-PDOs were then imaged with Olympus’ FV3000 confocal laser scanning microscope

Figure 2. F-PDOs immunostaining and clearing scheme / Schema di immunocolorazione e compensazione degli F-PDO

Imaging and analysis

 We used 10x or 30x magnification with 2 μm Z pitch to capture images of the cleared F-PDOs for 3D analysis. An appropriate Z pitch setting is important for accurate 3D cell analysis. The images were then imported into NoviSight™ software and reconstructed in 3D. NoviSight software can recognize 3D objects, such as a nuclei, and convert them into quantitative data.

Results 3D quantification of F-PDO morphology NoviSight software enabled us to quantify PDOs using several Z-plane images. By staining their nuclei, the analysis software captured the whole structure and enabled single cell recognition (Fig. 3A). It also added each recognized object on the graph as a single plot. When the software recognized each nucleus as an object, we extracted Ki67 positive cells both graphically and three dimensionally by gating high Ki67 intensity plots (Fig. 3B). Using these methods, we quantified the F-PDO’s cell number, volume, cell density, and Ki67 positive cell ratio (Fig. 3C). We found RLUN21’s Ki67 positive ratio was lower than the others. Also, the larger cytoplasm RLUN21 may have caused its low cell density.

Figure 3. 3D quantification of F-PDOs morphology  /  Quantificazione 3D della morfologia degli F-PDO

A. Original 3-side views of RLUN21, NoviSight 3D nuclear recognition (3-sides and volume view) and NoviSight structure recognition. / Viste originali su 3 lati di RLUN21, riconoscimento nucleare NoviSight 3D (vista su 3 lati e volume) e riconoscimento della struttura NoviSight.

B. Ki67 positive/negative cells were sorted by Ki67 intensity. NoviSight software can display sorted cells in a “Gallery view.” / Le cellule Ki67 positive/negative sono state ordinate per intensità Ki67. Il software NoviSight può visualizzare le celle ordinate in una "vista Galleria".

 C. Classified Ki67 positive cells can be displayed in 3D with a red outline. /  Le cellule positive Ki67 classificate possono essere visualizzate in 3D con un contorno rosso

D. Quantitative data of F-PDOs. / Dati quantitativi degli F-PDO

3D drug distribution analysis

 When we added the HyLight-555-labeled Erbitux or Herceptin to each F-PDO, Erbitux uniformly bound RLUN21 from its surface while Herceptin irregularly bound RLUN21. NoviSight™ software’s volume recognition module quantified the antibodydrug-positive volume ratio (Fig. 4A). We then used NoviSight software to quantify the difference in binding styles since it can modify the analysis-targeted region. To do so, we created two targeted regions: a reduced intra-PDO volume region from the surface at a certain percentage and an outline volume region with any width. We then calculated antibody drug intensity within both volumes. We noticed a large quantitative difference between the reduced intra-PDO volume and outline volume in Erbitux-treated RLUN21, while there was a non-significant difference found in Herceptin-treated RLUN21. This means Erbitux strongly bound to the RLUN21 outline region while Herceptin bound to RLUN21 without bias. This method enabled us to quantitatively show antibody drug distribution within a PDO sample population.

Figure 4. 3D quantification of antibody drug distribution / Quantificazione 3D della distribuzione dei farmaci anticorpali

A. 3-side images of F-PDOs treated with Erbitux or Herceptin, and NoviSight volume recognition of antibody drug bindings. The graph shows antibody binding volume in whole volume. / Immagini a 3 lati di F-PDO trattati con Erbitux o Herceptin e riconoscimento del volume NoviSight dei legami farmacologici dell'anticorpo. Il grafico mostra il volume di legame dell'anticorpo in volume intero.

 B. NoviSight region modification module. NoviSight software can modify the analysis-targeted region to provide quantitative data in the limited region. / Modulo di modifica della regione NoviSight. Il software NoviSight può modificare la regione di destinazione dell'analisi per fornire dati quantitativi nella regione limitata.

Conclusion

 In this study, we revealed that NoviSight software can perform quantitative analysis of PDOs morphologically and pharmacologically using images captured by Olympus’ FV3000 confocal laser scanning microscope. By combining the high-resolution images of the FV3000 microscope with the high recognition accuracy of NoviSight software, we can produce more reliable quantitative results.

ITALIANO

Le immagini confocali di organoidi tumorali (PDO) derivati ​​dal paziente sono state analizzate quantitativamente utilizzando il software NoviSight™ 3D per valutarne le caratteristiche morfologiche ed il legame anticorpale dei farmaci a bersaglio molecolare.

Introduzione 

I modelli di tessuto 3D sono popolari per la scoperta di farmaci poiché imitano il microambiente in vivo. I PDO sono uno degli strumenti più potenti per ricapitolare la risposta al farmaco dei pazienti originali. Infatti, uno studio recente rivela che il profilo fenotipico e genotipico dei PDO presenta un alto grado di somiglianza con il tumore del paziente originale. Ancora più importante, i PDO potrebbero prevedere la reattività del farmaco con una precisione superiore all'80%. Utilizzando gli organoidi tumorali derivati ​​dal paziente di Fukushima (F-PDO®), il microscopio confocale a scansione laser FLUOVIEW™ FV3000 di Olympus ed il software di analisi 3D NoviSight™, offriamo un nuovo flusso di lavoro per lo studio della morfologia della DOP e della distribuzione dei farmaci.

Benefici

• Immaginare e analizzare i PDO conservando le informazioni nella loro struttura 3D.

• Il software NoviSight può identificare oggetti in 3D, classificare gli oggetti e fornire dati statistici.

Metodi

Preparazione cellulare

Per preparare le cellule, abbiamo utilizzato tre tipi di F-PDO polmonari (RLUN5, RLUN16 e RLUN21). RLUN5 è stato coltivato da un tumore di carcinoma adenosquamoso mentre RLUN16 e RLUN21 sono stati coltivati ​​da un tumore di carcinoma squamoso. RLUN21 forma grandi aggregati cellulari e presenta un citoplasma più grande degli altri (Fig. 1). Gli F-PDO sono stati quindi centrifugati, raccolti e fissati con paraformaldeide al 4% durante la notte. Erbitux®, un inibitore del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), e Herceptin®, un inibitore del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano (HER2), sono stati marcati con HiLyte™ Fluor 555 (Chemical Dojin) e incubati con F-PDO per tre ore.

Immunocolorazione e schiarimento

Abbiamo eseguito l'Hama et al. protocollo di immunocolorazione con qualche modifica (Fig. 2). Ciascun F-PDO fissato è stato incubato durante la notte con un anticorpo Ki67 (Abcam, 16667) e diluito con una soluzione AbScale (0,33 M Urea e 0,2% Triton-X100). Dopo il lavaggio con AbScale, gli F-PDO sono stati incubati con un secondo anticorpo per tre ore e diluiti con AbScale. Dopo il lavaggio con la soluzione di risciacquo AbScale per un'ora, gli F-PDO sono stati riparati con paraformaldeide al 4%. Quindi sono stati lavati con una soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e incubati durante la notte utilizzando il reagente di chiarificazione ScaleS4 con DAPI. Gli F-PDO eliminati sono stati quindi ripresi con il microscopio a scansione laser confocale FV3000 di Olympus

Imaging e analisi

Abbiamo utilizzato un ingrandimento 10x o 30x con passo Z di 2 μm per acquisire immagini degli F-PDO eliminati per l'analisi 3D. Un'impostazione appropriata del passo Z è importante per un'analisi cella 3D accurata. Le immagini sono state poi importate nel software NoviSight™ e ricostruite in 3D. Il software NoviSight può riconoscere oggetti 3D, come nuclei, e convertirli in dati quantitativi.

Risultati 

Quantificazione 3D della morfologia dell'F-PDO Il software NoviSight ci ha consentito di quantificare i PDO utilizzando diverse immagini del piano Z. Colorando i loro nuclei, il software di analisi ha catturato l'intera struttura e ha permesso il riconoscimento di singole cellule (Fig. 3A). Ha anche aggiunto ogni oggetto riconosciuto sul grafico come un singolo grafico. Quando il software ha riconosciuto ogni nucleo come un oggetto, abbiamo estratto le cellule positive Ki67 sia graficamente che tridimensionalmente mediante gating grafici ad alta intensità Ki67 (Fig. 3B). Utilizzando questi metodi, abbiamo quantificato il numero di cellule dell'F-PDO, il volume, la densità cellulare e il rapporto di cellule positive Ki67 (Fig. 3C). Abbiamo trovato che il rapporto positivo Ki67 di RLUN21 era inferiore agli altri. Inoltre, il citoplasma più grande RLUN21 potrebbe aver causato la sua bassa densità cellulare.

Analisi 3D della distribuzione dei farmaci

Quando abbiamo aggiunto l'Erbitux o l'Herceptin etichettati con HyLight-555 a ciascun F-PDO, Erbitux ha legato uniformemente RLUN21 dalla sua superficie mentre Herceptin ha legato irregolarmente RLUN21. Il modulo di riconoscimento del volume del software NoviSight™ ha quantificato il rapporto di volume anticorpo farmaco-positivo (Fig. 4A). Abbiamo quindi utilizzato il software NoviSight per quantificare la differenza negli stili di rilegatura poiché può modificare la regione di destinazione dell'analisi. Per fare ciò, abbiamo creato due regioni mirate: una regione di volume intra-PDO ridotta dalla superficie a una certa percentuale e una regione di volume di contorno con qualsiasi larghezza. Abbiamo quindi calcolato l'intensità del farmaco anticorpale all'interno di entrambi i volumi. Abbiamo notato una grande differenza quantitativa tra il volume intra-PDO ridotto e il volume di contorno nella RLUN21 trattata con Erbitux, mentre è stata riscontrata una differenza non significativa nella RLUN21 trattata con Herceptin. Ciò significa che Erbitux è fortemente legato alla regione del contorno RLUN21 mentre Herceptin è legato a RLUN21 senza pregiudizi. Questo metodo ci ha permesso di mostrare quantitativamente la distribuzione del farmaco anticorpale all'interno di una popolazione campione DOP.

Conclusione

 In questo studio, abbiamo rivelato che il software NoviSight può eseguire analisi quantitative dei PDO dal punto di vista morfologico e farmacologico utilizzando le immagini catturate dal microscopio a scansione laser confocale FV3000 di Olympus. Combinando le immagini ad alta risoluzione del microscopio FV3000 con l'elevata precisione di riconoscimento del software NoviSight, possiamo produrre risultati quantitativi più affidabili.

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Olympus/eBook_Advanced_3DCellular_Models.pdf?__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1637723101130.1637757744997.212&__hssc=8807082.1.1637757744997&__hsfp=2530671978&hsCtaTracking=255c84f9-9218-455a-8eab-d6d31717e14c%7C2c6f4b44-5063-4bda-919c-4b50496a3fed