Forty-two Color Flow Cytometry Panel Data Collected with the ID7000™ Spectral Cell Analyzer for Identifying Cellular Subsets in Human Peripheral Blood / Quarantadue dati del pannello di citometria a flusso di colore raccolti con l'analizzatore di cellule spettrali ID7000™ per l'identificazione di sottoinsiemi cellulari nel sangue periferico umano

Forty-two Color Flow Cytometry Panel Data Collected with the ID7000™ Spectral Cell Analyzer for Identifying Cellular Subsets in Human Peripheral Blood / Quarantadue dati del pannello di citometria a flusso di colore raccolti con l'analizzatore di cellule spettrali ID7000™ per l'identificazione di sottoinsiemi cellulari nel sangue periferico umano

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Major cell subsets in human blood. Stem cells and progenitor cells in tissues such as the bone marrow, the thymus, and the lymph nodes give rise to a diverse set of innate and adaptive immune system cells as well as the non-immune populations. HSC, hematopoietic stem cell. CMP, common myeloid progenitor. CLP, common lymphoid progenitor. MEP, megakaryocytic and erythroid progenitor. GMP, granulocytic and monocytic progenitor. EB, erythroblast. PLT, platelets. RBC, red blood cells. Various CLP progeny are discussed in the results section. /  Principali sottoinsiemi di cellule nel sangue umano. Le cellule staminali e le cellule progenitrici in tessuti come il midollo osseo, il timo ed i linfonodi danno origine ad un insieme diversificato di cellule del sistema immunitario innato e adattativo, nonché alle popolazioni non immunitarie. HSC, cellula staminale ematopoietica. CMP, progenitore mieloide comune. CLP, capostipite linfoide comune. MEP, progenitore megacariocitico ed eritroide. GMP, progenitore granulocitico e monocitico. EB, eritroblasto. PLT, piastrine. globuli rossi, globuli rossi. Nella sezione dei risultati vengono discusse varie progenie CLP.

Introduction

Multicolor flow cytometry is a high-throughput cell analysis technique that is essential for studying the biology of various cell subpopulations at a single-cell level. The peripheral immune system consists of various cellular compartments including the classical T, B, and NK cells, various innate lymphoid and myeloid subpopulations, as well as progenitor cells (Fig. 1). All these subsets are defined flow cytometrically by staining for antigens displayed on the cell surface or expressed intracellularly. One key limitation in the ability to classify the subsets had been the availability of antibody-fluorochrome combinations, as well as instrumentation’s capability to distinguish the large number of individual fluorescence signals that define each subpopulation. Of late, there have been significant improvements in instrument capability, and with an increase in fluorochrome choices available to researchers, the ability to study rare subsets of cells in normal and disease states has received a significant boost. In this study, the ID7000™ spectral cell analyzer, equipped with five lasers, has been used to define various lymphoid, myeloid, and progenitor subsets in a human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) sample using 42 fluorescent markers.

Materials and Methods

At an approved laboratory, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated from commercially available fresh blood of a healthy donor using the Lymphopure™ solution, following all biosafety precautions. The PBMC monolayer was collected post-centrifugation and washed with a chilled bovine serum albumin (BSA)/phosphate buffered saline (PBS) staining buffer, and the cell number was quantified. Ten million cells were stained at 4°C in the dark in the presence of the Super Bright Complete Staining Buffer (eBioscience) in BSA/ PBS. The panel’s dyes were split into four groups (not indicated) for performing the staining and washing steps in sequence. BUV and BV dyes were added individually into the cell suspension to reduce the chance of unwanted polymer dye interactions. After proper incubation and washing, cells were further stained with Zombie NIR™ viability dye per the manufacturer’s guidelines and with the secondary StreptavidinAlexa Fluor® 350 conjugate. Samples were then washed, fixed with 2% formaldehyde, and resuspended in PBS buffer for data acquisition on the ID7000 spectral cell analyzer. Unstained cells from the same donor were similarly treated and used in the data analysis steps for autofluorescence unmixing. Single-color controls were tested on both Sony antibody capture beads and the PBMC sample, with the former utilized in the unmixing matrix. Approximately 1 million events were acquired on the ID7000 at an intermediate flow rate with proper sample chilling and agitation. For reproducibility, all samples were split and acquired on two different ID7000 spectral cell analyzers on the same day. The same 42-color panel was repeated with another donor sample and run on an additional ID7000 instrument at a later date. All data analyses (spectral unmixing and gating) were performed using the ID7000 system software. 

Results

To identify the lymphoid and myeloid subpopulations, red blood cells (RBC), platelets (PLT), and the majority of granulocytes and monocytes, doublets, and dead cells were first excluded by gating. Forward scatter (FSC) and CD235ab/CD41 were used to exclude small and bright positive RBC and PLT events. Granulocytes were identified and excluded as CD16bright and CD24 doublepositive events. Next, CD14+ /SSChigh monocytes were excluded. Singlets were gated based on forward scatter height and area, and dead cells excluded by gating on Zombie NIR-negative events. Live cells were subdivided into CD3-positive and -negative subpopulations by plotting CD3 against a high-spillover channel CD24 PE-Alexa Fluor® 610. Live/CD3neg cells were further gated to identify B cells using the CD19 and CD20 co-expression. IgD and CD27 expression identified Naïve and Memory B-cell subpopulations (Naïve as IgD single-positive; Non-switched memory as IgD+ /CD27+ ; Switched memory as IgDneg/CD27+ ). CD24, CD38, CD20, and CD27 markers were used to identify plasmablasts (CD24neg/CD38bright/CD20neg/ CD27+ ;).

Live/CD3neg/CD20neg/CD19neg (NOT B) cells were gated based on HLA-DR and CD11c to identify dendritic cells (DC) (CD11c+ / HLA-DR+). DCs were further subdivided into the conventional CD141bright (++), conventional CD1c+, and the double-negative and CD141dim DC (DBL NEG DC) subpopulations. From DBL NEG DC, the non-classical CD16+ monocytes (NC MO) and the CD16neg/CD141dim DCs were further identified. CD16neg/CD141dim DC were also mostly CD123+ /HLA-DR+ (plot not shown). Additionally, CD11cneg/low (NOT B or DC) cells  were further subdivided into CD123+ and CD123neg populations. From the CD123+ gate, plasmacytoid DC (pDC, FcεRIαneg/HLA-DR+ ) and basophils (FcεRIα+ /HLA-DRneg) were then identified. The natural killer (NK) and non-NK subpopulations were identified. Live/CD3neg/ CD20neg/CD19neg/ CD11cneg/low cells were gated on the CD123neg subpopulation. Early (CD56 single-positive), mature (CD16+ /CD56+ ) and terminal (CD16+ /CD56neg) NK subpopulations were gated next (Fig. 3F, upper right plot). The non-NK, lineage negative (LIN NEG) cells were further gated based on CD34 and CD127/ IL-7Rα expression, identifying the committed hematopoietic progenitor subpopulation (cHPC, CD117+ /CD38+ ) and the noncytotoxic innate lymphoid cells (ILC1-3, CD117+/-/CRTH2+/-). CD3+ T cells and their various subpopulations were identified in Figure 3G and 3H. Live/CD3+ cells were first gated to identify the unconventional T-cell subsets. The CD161 and TCR Vα7.2 expression was used to identify the mucosal associated invariant T cells (MAIT). Non-MAIT cells were next gated for TCR γδ chains to identify various γδ T-cell subpopulations. Non-γδ/non-MAIT CD3+ cells were further subdivided based on CD56 expression to identify the NKT cells. Invariant NKT (iNKT) cells were identified as being co-positive for TCR Vα24-Jα18 and TCR Vβ11 chains (upper right plot). Conventional T-cell subsets were identified. Live/CD3+ cells, with the unconventional subsets excluded, were gated on the CD8 (T8) and the CD4 (T4) subsets (upper left plot). CD4 T-helper cells were further distinguished as regulatory (TREG, CD127low/C25bright) and non-regulatory T cells (T4 not TREG) using CD127 (IL-7Rα) and CD25 markers. CD4 T cells and Treg cells were then gated for various T-helper subsets using CD45RA and CCR4 marker expression (middle plots). Both cell types were further subdivided into their respective memory and T-helper subsets using CXCR3 and CCR6 expression (Th1, Th2, Th1/Th17, and Th17). It shows additional markers we utilized in assessing various cell functions (for example, activation, exhaustion, senescence) in both the conventional and unconventional T-cell subsets. Data is not shown for brevity.

It describes monocyte gating. First, total events were gated for monocytes based on scatter and then to exclude various lineages (data not shown for brevity). Monocytes were then identified as CD14+ and HLA-DR+/- (lower middle plot). Monocytes were gated for various subpopulations using CD14 and CD16 markers. A non-classical monocyte phenotype  was also confirmed by Boolean gating (data not shown). 

Discussion Panel design considerations

The panel design considerations included marker-fluorochrome availability, dye brightness index, antigen density, and the spillover spreading matrix and the resultant cross-stain index, among others. The previously published work in the field such as OMIP-069 and other similar panels were considered as well. One of the factors affecting high parameter panel design is the spillover spreading error, because a significant number of dyes have a high degree of spectral similarity. As a result, those dyes that are impacted by another dye’s fluorescence overlap cannot be measured precisely and thus have a higher signal variance. This measurement error is revealed by the unmixing algorithm as the signal spread of the “offender” dye into the adjacent (offended) dye’s parametric channel. Data spread in turn may lead to a poor signal resolution between single- and double-positive biological subpopulations. To detect and avoid problematic dye combinations, the spillover spread matrix  has become a commonly used tool that also guided the panel design. For instance, the SSM shows that BB515 interacts with Alexa Fluor® 488, while BV480 and BV510 interact with BUV496, PE with Spark YG™ 581, and PE-eFluor™ 610 interacts with Alexa Fluor® 594. Whereas a smaller panel would avoid these combinations, no such option often exists when working with a high-parameter panel. Therefore, one of our strategies was to assign the strongly interacting dye pairs to the well-established, mutually exclusive biological markers such as CD19 (on BB515), CD8 (on Alexa Fluor® 488), and CD4 (on Super Bright 550). Similarly, Alexa Fluor® 594 was assigned to the CD14 marker to identify SSChigh monocytes that do not express the markers on offender dyes. As a result of this approach, no biological double-positive populations would be expected to interfere with the downstream gating. Such an arrangement also implies that best gating may often be achieved by plotting the interacting dyes one against another, especially where a boundary between the on/off-expressed antigens is clearly distinguishable. Conversely, in cases when two lineage markers are co-expressed and do not need to be distinguished (for example, CD19 and CD20), they may be safely combined. This strategy allowed us to preserve the dyes with lower SSM values for use on markers with a more widespread expression pattern across multiple lineages and/or subpopulations. In the context of a fully stained sample with 42 colors, a pairwise marker resolution does not solely depend on the data spread in the positive population(s) of a given dye pair. It is equally imperative to manage the data spread of the doublenegative population that arises from additional fluorochrome interactions.  It describes our approach where pre-gating to exclude certain lineages leads to an improved signal resolution. As shown, B cells (red events) and other lineage populations (not colored for brevity) fall mainly in the double-negative plot area. Their fluorochromes lead to the data spread that reduces the resolution of CD56 and CD16 (NK lineage markers). As seen in the SSM, the BUV496 parameter is impacted by the spreading error from BV480 (IgD) and BV510 (FcεRIα+ basophils). Gating out B cells and CD123+ cells first helped us to better resolve the NK subpopulations. 

Spectral reference adjustments 

Spectral cell analysis gives user the ability to re-use single-color controls from the spectral library. The library is very similar to spectral viewers but allows us to directly apply spectral signatures to unmix the sample data. This approach is possible because Sony standardizes the PMT array performance so the detectors always achieve the same target intensity values throughout the detector range and with time. Related to the PMT performance standardization, the controls are saved as proportional spectral distributions, enabling their re-use in the unmixing math. 

For best practice in our 42-color panel, we recorded all the compensation bead controls on the same day and at the same voltage settings as the fully stained sample. The controls were overall of high fidelity, faithfully matching the spectra in the fully stained sample, as judged by very minimal unmixing issues. Of those cases, most were due to dye combinations with a high degree of spectral similarity (for example, BB515 over-unmixed out of Spark Blue™ 550, and under-unmixed out of Alexa Fluor® 488;. Other unmixing anomalies were mainly the tandem dye mismatches that resulted in a slight over-unmixing. We made alterations to the unmixing math only sparingly, using the biology as our guide. We adjusted the over-unmixed mismatches if the sample’s single-positive subpopulation clearly fell below the mean fluorescence intensity of the double-negative population in the spillover parameter. In the few under-unmixing cases, the panel was designed to keep the overlapping dyes on separate lineages. This allowed us to correct the mismatches of the reference spectra while keeping the separation indices unaffected. An additional way to handle the underunmixing issues is by staining the fluorescence-minus-one controls, particularly in places where co-expressed markers make it difficult to adjust the unmixing matrix.

Conclusions 

In this study, our considerations were to determine the best fluorochrome set to use for 40- to 45-color panels on the ID7000. We aimed to incorporate a set of core markers that utilize the most challenging fluorochrome combinations while leaving the less challenging fluorochromes available for substitutions by users to make derivative panels. We used tools such as the Spectral Reference Library and the Spillover Spreading Matrix to test for ideal fluorochrome combinations, with at least three more dyes ready to expand the panel size with this five-laser instrument configuration. We also optimized our panel design and gating methods to enable good marker/ fluorochrome choices in the future. 

ITALIANO

Introduzione

La citometria a flusso multicolore è una tecnica di analisi cellulare ad alto rendimento che è essenziale per studiare la biologia di varie sottopopolazioni cellulari a livello di una singola cellula. Il sistema immunitario periferico è costituito da vari compartimenti cellulari tra cui le classiche cellule T, B e NK, varie sottopopolazioni linfoidi e mieloidi innate, nonché cellule progenitrici (Fig. 1). Tutti questi sottoinsiemi sono definiti citometricamente a flusso mediante la colorazione degli antigeni visualizzati sulla superficie cellulare o espressi a livello intracellulare. Una limitazione chiave nella capacità di classificare i sottoinsiemi era stata la disponibilità di combinazioni di anticorpi-fluorocromi, nonché la capacità della strumentazione di distinguere il gran numero di segnali di fluorescenza individuali che definiscono ciascuna sottopopolazione. Di recente, ci sono stati miglioramenti significativi nella capacità dello strumento e, con un aumento delle scelte di fluorocromi a disposizione dei ricercatori, la capacità di studiare rari sottogruppi di cellule in stati normali e patologici ha ricevuto un aumento significativo. In questo studio, l'analizzatore di cellule spettrali ID7000™, dotato di cinque laser, è stato utilizzato per definire vari sottoinsiemi linfoidi, mieloidi e progenitori in un campione di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) utilizzando 42 marcatori fluorescenti.

Materiali e metodi

In un laboratorio approvato, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate dal sangue fresco disponibile in commercio di un donatore sano utilizzando la soluzione Lymphopure™, seguendo tutte le precauzioni di biosicurezza. Il monostrato PBMC è stato raccolto dopo la centrifugazione e lavato con un tampone di colorazione di albumina di siero bovino (BSA)/soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ed il numero di cellule è stato quantificato. Dieci milioni di cellule sono state colorate a 4°C al buio in presenza del Super Bright Complete Staining Buffer (eBioscience) in BSA/PBS. I coloranti del pannello sono stati suddivisi in quattro gruppi (non indicati) per eseguire le fasi di colorazione e lavaggio in sequenza. I coloranti BUV e BV sono stati aggiunti individualmente alla sospensione cellulare per ridurre la possibilità di interazioni indesiderate dei coloranti polimerici. Dopo un'incubazione ed un lavaggio adeguati, le cellule sono state ulteriormente colorate con il colorante di vitalità Zombie NIR™ secondo le linee guida del produttore e con il coniugato StreptavidinaAlexa Fluor® 350 secondario. I campioni sono stati quindi lavati, fissati con formaldeide al 2% e risospesi nel buffer PBS per l'acquisizione dei dati sull'analizzatore di cellule spettrali ID7000. Le cellule non colorate dello stesso donatore sono state trattate in modo simile ed utilizzate nelle fasi di analisi dei dati per la separazione dell'autofluorescenza. I controlli a colore singolo sono stati testati sia sulle microsfere di cattura dell'anticorpo Sony che sul campione PBMC, con il primo utilizzato nella matrice di non miscelazione. Circa 1 milione di eventi sono stati acquisiti sull'ID7000 a una portata intermedia con raffreddamento e agitazione del campione adeguati. Per la riproducibilità, tutti i campioni sono stati divisi e acquisiti su due diversi analizzatori di cellule spettrali ID7000 lo stesso giorno. Lo stesso pannello a 42 colori è stato ripetuto con un altro campione di donatore ed eseguito su uno strumento ID7000 aggiuntivo in un secondo momento. Tutte le analisi dei dati (unmixing spettrale e gating) sono state eseguite utilizzando il software di sistema ID7000.

Risultati

Per identificare le sottopopolazioni linfoidi e mieloidi, i globuli rossi (RBC), le piastrine (PLT) e la maggior parte dei granulociti e dei monociti, dei doppietti e delle cellule morte sono stati inizialmente esclusi dal gating. Forward scatter (FSC) e CD235ab/CD41 sono stati utilizzati per escludere eventi RBC e PLT positivi piccoli e luminosi. I granulociti sono stati identificati ed esclusi come eventi CD16bright e CD24 doublepositivi. Successivamente, sono stati esclusi i monociti CD14+ /SSChigh. Le canottiere sono state gated in base all'altezza e all'area della dispersione in avanti e le cellule morte escluse dal gating su eventi Zombie NIR-negativi. Le cellule vive sono state suddivise in sottopopolazioni CD3-positive e -negative tracciando CD3 contro un canale CD24 PE-Alexa Fluor® 610 ad alto spillover. Le cellule vive/CD3neg sono state ulteriormente delimitate per identificare le cellule B utilizzando la co-espressione CD19 e CD20. L'espressione di IgD e CD27 ha identificato le sottopopolazioni di cellule B naïve e di memoria (naïve come IgD single-positive; memoria non commutata come IgD+ /CD27+; memoria commutata come IgDneg/CD27+). I marcatori CD24, CD38, CD20 e CD27 sono stati utilizzati per identificare i plasmablasti (CD24neg/CD38bright/CD20neg/CD27+;).

Le cellule vive/CD3neg/CD20neg/CD19neg (NON B) sono state gated in base a HLA-DR e CD11c per identificare le cellule dendritiche (DC) (CD11c+ / HLA-DR+). Le DC sono state ulteriormente suddivise nelle sottopopolazioni CD141bright (++), CD1c+ convenzionale e CD141dim DC (DBL NEG DC) a doppio negativo. Da DBL NEG DC, sono stati ulteriormente identificati i monociti CD16+ non classici (NC MO) e le DC CD16neg/CD141dim. CD16neg/CD141dim DC erano anche principalmente CD123+ /HLA-DR+ (trama non mostrata). Inoltre, le cellule CD11cneg/basse (NON B o DC) sono state ulteriormente suddivise in popolazioni CD123+ e CD123neg. Dal gate CD123+ sono state quindi identificate le DC plasmocitoidi (pDC, FcεRIαneg/HLA-DR+) ed i basofili (FcεRIα+ /HLA-DRneg). Sono state identificate le sottopopolazioni natural killer (NK) e non NK. 

Le cellule live/CD3neg/CD20neg/CD19neg/CD11cneg/low sono state gated sulla sottopopolazione CD123neg. Le sottopopolazioni NK precoci (CD56 singolo-positivo), mature (CD16+ /CD56+) e terminali (CD16+ /CD56neg) sono state successivamente delimitate. Le cellule non NK, lineage negative (LIN NEG) sono state ulteriormente gated in base all'espressione CD34 e CD127/IL-7Rα, identificando la sottopopolazione progenitrice ematopoietica impegnata (cHPC, CD117+ /CD38+) e le cellule linfoidi innate non citotossiche (ILC1-3, CD117+/-/CRTH2+/-). Le cellule T CD3+ e le loro varie sottopopolazioni sono state identificate. Le cellule vive/CD3+ sono state prima gated per identificare i sottoinsiemi di cellule T non convenzionali. L'espressione CD161 e TCR Vα7.2 è stata utilizzata per identificare le cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT). Le cellule non MAIT sono state successivamente controllate per le catene TCR γδ per identificare varie sottopopolazioni di cellule T γδ. Le cellule CD3+ non γδ/non MAIT sono state ulteriormente suddivise in base all'espressione di CD56 per identificare le cellule NKT. Le cellule NKT invarianti (iNKT) sono state identificate come co-positive per le catene TCR Vα24-Jα18 e TCR Vβ11. I sottoinsiemi di cellule T convenzionali sono stati identificati. Le cellule vive/CD3+, con l'esclusione dei sottoinsiemi non convenzionali, sono state gated sui sottoinsiemi CD8 (T8) e CD4 (T4) (trama in alto a sinistra). Le cellule T-helper CD4 sono state ulteriormente distinte come cellule T regolatorie (TREG, CD127low/C25bright) e non regolatorie (T4 non TREG) utilizzando marcatori CD127 (IL-7Rα) e CD25. Le cellule T CD4 e le cellule Treg sono state quindi controllate per vari sottoinsiemi di T-helper utilizzando l'espressione del marcatore CD45RA e CCR4 (trame centrali). Entrambi i tipi di cellule sono stati ulteriormente suddivisi nei rispettivi sottoinsiemi di memoria e T-helper utilizzando l'espressione CXCR3 e CCR6 (Th1, Th2, Th1/Th17 e Th17). Mostra ulteriori marcatori che abbiamo utilizzato per valutare varie funzioni cellulari (ad esempio, attivazione, esaurimento, senescenza) nei sottoinsiemi di cellule T convenzionali e non convenzionali. I dati non vengono mostrati per brevità. Descrive il gating dei monociti. In primo luogo, gli eventi totali sono stati controllati per i monociti in base alla dispersione e quindi per escludere vari lignaggi (dati non mostrati per brevità). I monociti sono stati quindi identificati come CD14+ e HLA-DR+/- (trama medio-basso). I monociti sono stati gated per varie sottopopolazioni utilizzando marcatori CD14 e CD16. Un fenotipo monocitario non classico è stato confermato anche dal gating booleano (dati non mostrati).

Considerazioni sulla progettazione del pannello di discussione

Le considerazioni sulla progettazione del pannello includevano la disponibilità del marcatore-fluorocromo, l'indice di luminosità del colorante, la densità dell'antigene e la matrice di diffusione dello spillover ed il risultante indice di colorazione incrociata, tra gli altri. Sono stati presi in considerazione anche i lavori pubblicati in precedenza nel campo come OMIP-069 e altri pannelli simili. Uno dei fattori che influenzano la progettazione di pannelli con parametri elevati è l'errore di diffusione dello spillover, poiché un numero significativo di coloranti ha un alto grado di somiglianza spettrale. Di conseguenza, quei coloranti che sono influenzati dalla sovrapposizione di fluorescenza di un altro colorante non possono essere misurati con precisione e quindi hanno una varianza del segnale maggiore. Questo errore di misurazione è rivelato dall'algoritmo di non miscelazione come la diffusione del segnale del colorante "autore del reato" nel canale parametrico del colorante adiacente (offeso). La diffusione dei dati a sua volta può portare a una scarsa risoluzione del segnale tra sottopopolazioni biologiche a singolo e doppio positivo. Per rilevare ed evitare combinazioni di coloranti problematiche, la matrice di diffusione dello spillover è diventata uno strumento comunemente utilizzato che ha guidato anche la progettazione del pannello. Ad esempio, l'SSM mostra che BB515 interagisce con Alexa Fluor® 488, mentre BV480 e BV510 interagiscono con BUV496, PE con Spark YG™ 581 e PE-eFluor™ 610 interagisce con Alexa Fluor® 594. Mentre un pannello più piccolo li eviterebbe combinazioni, spesso non esiste tale opzione quando si lavora con un pannello con parametri elevati. Pertanto, una delle nostre strategie era assegnare le coppie di coloranti fortemente interagenti ai marcatori biologici consolidati e mutualmente esclusivi come CD19 (su BB515), CD8 (su Alexa Fluor® 488) e CD4 (su Super Bright 550). Allo stesso modo, Alexa Fluor® 594 è stato assegnato al marcatore CD14 per identificare i monociti SSChigh che non esprimono i marcatori sui coloranti offensori.

Come risultato di questo approccio, nessuna popolazione biologica doppia positiva dovrebbe interferire con il gating a valle. Tale disposizione implica anche che il miglior gating può spesso essere ottenuto tracciando i coloranti interagenti uno contro l'altro, specialmente quando è chiaramente distinguibile un confine tra gli antigeni on/off espressi. Al contrario, nei casi in cui due marcatori di lignaggio sono co-espressi e non devono essere distinti (ad esempio, CD19 e CD20), possono essere combinati in modo sicuro. Questa strategia ci ha permesso di preservare i coloranti con valori di SSM inferiori per l'uso su marcatori con un modello di espressione più diffuso su più lignaggi e/o sottopopolazioni. Nel contesto di un campione completamente colorato con 42 colori, la risoluzione del marker a coppie non dipende esclusivamente dalla diffusione dei dati nella popolazione positiva di una data coppia di coloranti. È altrettanto imperativo gestire la diffusione dei dati della popolazione doublenegativa che deriva da ulteriori interazioni di fluorocromi. Descrive il nostro approccio in cui il pre-gating per escludere determinati lignaggi porta a una migliore risoluzione del segnale. Come mostrato, i linfociti B (eventi rossi) e altre popolazioni di lignaggio (non colorate per brevità) cadono principalmente nell'area del grafico a doppio negativo. I loro fluorocromi portano alla diffusione dei dati che riduce la risoluzione di CD56 e CD16 (marcatori del lignaggio NK, grafico a sinistra). Come visto nell'SSM, il parametro BUV496 è influenzato dall'errore di diffusione di BV480 (IgD) e BV510 (FcεRIα+ basofili). L'eliminazione delle cellule B e delle cellule CD123+ ci ha aiutato a risolvere meglio le sottopopolazioni NK.

Regolazioni di riferimento spettrale

L'analisi delle cellule spettrali offre all'utente la possibilità di riutilizzare i controlli a colore singolo dalla libreria spettrale. La libreria è molto simile ai visualizzatori spettrali, ma ci consente di applicare direttamente le firme spettrali per separare i dati del campione. Questo approccio è possibile perché Sony standardizza le prestazioni dell'array PMT in modo che i rivelatori raggiungano sempre gli stessi valori di intensità target in tutto l'intervallo del rivelatore e nel tempo. In relazione alla standardizzazione delle prestazioni PMT, i controlli vengono salvati come distribuzioni spettrali proporzionali, consentendo il loro utilizzare nella matematica unmixing.

Per la migliore pratica nel nostro pannello a 42 colori, abbiamo registrato tutti i controlli del tallone di compensazione lo stesso giorno e alle stesse impostazioni di tensione del campione completamente colorato. I controlli erano nel complesso di alta fedeltà, corrispondendo fedelmente agli spettri del campione completamente colorato, come giudicato da problemi di non miscelazione molto minimi. Di questi casi, la maggior parte era dovuta a combinazioni di coloranti con un alto grado di somiglianza spettrale (ad esempio, BB515 non miscelato in modo eccessivo da Spark Blue™ 550 e non miscelato in modo insufficiente da Alexa Fluor® 488;. Altre anomalie di non miscelazione erano principalmente disallineamenti di coloranti tandem che hanno provocato una leggera scomposizione eccessiva. Abbiamo apportato modifiche alla matematica di non miscelazione solo con parsimonia, utilizzando la biologia come guida. Abbiamo regolato le discrepanze non miscelate se la sottopopolazione positiva singola del campione è chiaramente scesa al di sotto dell'intensità media della fluorescenza della popolazione double-negativa nel parametro di spillover. Nei pochi casi di under-unmixing, il pannello è stato progettato per mantenere i coloranti sovrapposti su lignaggi separati. Ciò ha permesso di correggere i disallineamenti degli spettri di riferimento mantenendo inalterati gli indici di separazione. Un ulteriore modo per gestire i problemi di demixing è quello di colorare i controlli fluorescenza-meno-uno, in particolare nei punti in cui i marcatori co-espressi rendono difficile la regolazione del non miscelato matrice.

Conclusioni

In questo studio, le nostre considerazioni erano di determinare il miglior set di fluorocromi da utilizzare per pannelli da 40 a 45 colori sull'ID7000. Abbiamo mirato a incorporare una serie di marcatori principali che utilizzano le combinazioni di fluorocromi più impegnative lasciando i fluorocromi meno impegnativi disponibili per le sostituzioni da parte degli utenti per creare pannelli derivati. Abbiamo utilizzato strumenti come la Spectral Reference Library e la Spillover Spreading Matrix per testare le combinazioni ideali di fluorocromi, con almeno altri tre coloranti pronti per espandere le dimensioni del pannello con questa configurazione di strumenti a cinque laser. Abbiamo anche ottimizzato il progetto del pannello ed i metodi di gating per consentire una buona scelta di marcatori/fluorocromi in futuro.

Da:

https://s3.amazonaws.com/creative.sonybiotechnology.com/ID7000/Sony+ID7000+Application+Note+42-Color+Flow+Cytometry+Panel+Data+Collected+with+the+ID7000+Spectral+Cell+Analyzer.pdf?utm_campaign=ID700-42c-tech-note&utm_medium=email&_hsmi=217568790&_hsenc=p2ANqtz-_w9x7-2MgtK6CGd6BrzoGFmfZeeDb3mkmo_8yUfSoU7F19pQd1yEEDk3vJ5e2pBvNney7QeMDvI9Binijok56L5f5f5IdnLjkViaEo_dwdOhMo7n8&utm_content=download-now&utm_source=thescientist