AUTOPHAGY REGULATION AND MITOPHAGY / REGOLAZIONE AUTOFAGIA E MITOFAGIA

AUTOPHAGY REGULATION AND MITOPHAGY / REGOLAZIONE AUTOFAGIA E MITOFAGIA

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Post-translational regulations vs transcriptional regulations / Regolamenti post-traduzionali vs regolamenti trascrizionali

Under normal conditions, a constitutive basal autophagy ensures intracellular quality control. However, in stress conditions, such as nutrient deprivation, the autophagy process is rapidly induced to maintain the pool of amino acids and ensure cell survival. Multiple regulations in the autophagic pathways occur at both post-translational and transcriptional levels. 

Post-translational regulations 

The main post-translational modifications involved in autophagy regulation are phosphorylation, ubiquitination, and acetylation. When nutrients are present, the upstream AKT kinase phosphorylates and activates mTORC1, which in turn inhibits autophagy by phosphorylating ULK1 at Ser638 and Ser758, as well as its associated partners ATG13 at Ser389 and AMBRA1 at Ser52. In nutrient deprivation conditions, mTORC1 is downregulated and AMBRA1 is dephosphorylated. This results in ULK1 autophosphorylation at Ser180 and the subsequent phosphorylation of ATG13 (Ser389), ATG101 (Ser11 and Ser203), FIP200 (Ser943, Ser986, Ser1323), and AMBRA1 (Ser465, Ser635). AMP-activated protein kinase (AMPK), which is a nutrient sensor, is a positive regulator of autophagy involved in the activation of ULK1 by phosphorylation at Ser317 and Ser777. In fact, the ULK complex is an upstream hub which integrates and relays the activities of mTORC1 and AMPK. A complex network of autophagic regulators modulates autophagy either positively (green arrows in Figure 1) or negatively (red arrows in Figure 1). For example, dephosphorylated AMBRA interacting with ULK1 leads to TRAF6 mediated-ULK1 ubiquitination and stabilization; phosphorylation of BCL2 by JNK releases Beclin-1 and promotes autophagy, whereas EGFR and Cdk5 phosphorylate and deactivate Beclin-1 functions. While MAPK15/ERK8 positively regulates autophagy through pro-LC3 phosphorylation, PKA plays the opposite role. Autophagy is inhibited by the acetyltransferase p300, which acetylates ATG7, ATG5, LC3, and ATG12, whereas the deacetylase SIRT1 is a positive autophagy regulator.

Transcriptional regulations 

At the transcriptional level, TFEB and FOXO3 are key transcriptional factors which positively regulate both autophagy and lysosomal biogenesis. Transcription Factor EB (TFEB) is considered the master regulator of lysosomal and autophagic function. Inactive TFEB is phosphorylated by mTOR and sequestered in the cytoplasm. Upon dephosphorylation by phosphatases such as Calcineurin, TFEB translocates into the nucleus, where it binds to specific CLEAR DNA sequences and induces the upregulation of proteins involved in lysosome biogenesis and in the autophagy pathway. Whereas the transcription factors HIF1, ATF4, PPARa, or NRF2 also positively regulate autophagy, ZSCAN3, FXR, TCF4, or NFKB down regulate it.

Spotlight on mitophagy 

Mitochondria are essential organelles that provide cellular energy and contribute to cell death. This organelle is continuously exposed to intra and extra mitochondrial threats. For instance, mitochondrial oxidative phosphorylation produces ATP and by-products such as reactive oxygen species (ROS) that can cause mitochondrial DNA damage. The removal of damaged mitochondria is critical for maintaining cellular homeostasis, and here mitophagy plays a key role in ensuring a selective control process to maintain mitochondria quality and quantity. Mitophagy is controlled by two major proteins: PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) which is a serine/threonine-protein kinase, and PARKIN which is an E3-ubiquitin ligase. PINK1 is addressed to heathy polarized mitochondria through a mitochondrial targeting sequence and is processed by matrix processing peptidases (MPP) and the PARL protease in the mitochondrial inner membrane. The 52kD mature form of PINK is then released into the cytosol, where it is ubiquitinated and degraded by the proteasome. In damaged depolarized mitochondria, PINK1 accumulates on the mitochondrial outer membrane at the TOM complex (Translocase of the Outer Membrane). Following its autophosphorylation, activated PINK1 in turn phosphorylates ubiquitin on serine 65 (Ser65) which promotes Parkin stabilization. In an active conformation, PINK1 directly phosphorylates and fully activates Parkin. Once activated, Parkin ubiquitinates many targets at the Mitochondrial Outer Membrane (MOM), such as mitofusin (MNF), VDAC, or the pro-apoptotic factor BAK, as well as cytosolic proteins. Polyubiquitinated mitochondrial substrates bind to LC3 adapters, such as OPTN or NDP52, which are phosphorylated by TBK1. Finally, damaged mitochondria are trapped in autophagosomes and further degraded by lysosomal enzymes. Figure 2 showcases the mechanisms in healthy versus damaged mitochondria in more detail.

 

Figure 2. Mechanisms of mitophagy in healthy and damaged mitochondria. / Meccanismi della mitofagia nei mitocondri sani e danneggiati.

ITALIANO

In condizioni normali, un'autofagia basale costitutiva garantisce il controllo della qualità intracellulare. Tuttavia, in condizioni di stress, come la privazione di nutrienti, il processo di autofagia viene rapidamente indotto per mantenere il pool di aminoacidi e garantire la sopravvivenza cellulare. Molteplici regolazioni nelle vie autofagiche si verificano sia a livello post-traduzionale che trascrizionale.

Norme post-traduzionali

Le principali modifiche post-traduzionali coinvolte nella regolazione dell'autofagia sono la fosforilazione, l'ubiquitinazione e l'acetilazione. Quando sono presenti nutrienti, la chinasi AKT a monte fosforila e attiva mTORC1, che a sua volta inibisce l'autofagia fosforilando ULK1 a Ser638 e Ser758, così come i suoi partner associati ATG13 a Ser389 e AMBRA1 a Ser52. In condizioni di deprivazione di nutrienti, mTORC1 è sottoregolato e AMBRA1 è defosforilato. Ciò si traduce nell'autofosforilazione di ULK1 a Ser180 e nella successiva fosforilazione di ATG13 (Ser389), ATG101 (Ser11 e Ser203), FIP200 (Ser943, Ser986, Ser1323) e AMBRA1 (Ser465, Ser635). La protein chinasi attivata da AMP (AMPK), che è un sensore di nutrienti, è un regolatore positivo dell'autofagia coinvolto nell'attivazione di ULK1 mediante fosforilazione a Ser317 e Ser777. In effetti, il complesso ULK è un hub a monte che integra e trasmette le attività di mTORC1 e AMPK. Una complessa rete di regolatori autofagici modula l'autofagia positivamente (frecce verdi nella Figura 1) o negativamente (frecce rosse nella Figura 1). Ad esempio, AMBRA defosforilato che interagisce con ULK1 porta all'ubiquitinazione e stabilizzazione mediata da TRAF6-ULK1; la fosforilazione di BCL2 da parte di JNK rilascia Beclin-1 e promuove l'autofagia, mentre EGFR e Cdk5 fosforilano e disattivano le funzioni di Beclin-1. Mentre MAPK15/ERK8 regola positivamente l'autofagia attraverso la fosforilazione pro-LC3, la PKA svolge il ruolo opposto. L'autofagia è inibita dall'acetiltransferasi p300, che acetila ATG7, ATG5, LC3 e ATG12, mentre la deacetilasi SIRT1 è un regolatore positivo dell'autofagia.

Regolamento trascrizionale

A livello trascrizionale, TFEB e FOXO3 sono fattori trascrizionali chiave che regolano positivamente sia l'autofagia che la biogenesi lisosomiale. Il fattore di trascrizione EB (TFEB) è considerato il principale regolatore della funzione lisosomiale e autofagica. Il TFEB inattivo viene fosforilato da mTOR e sequestrato nel citoplasma. Dopo la defosforilazione da parte di fosfatasi come la calcineurina, il TFEB si trasloca nel nucleo, dove si lega a specifiche sequenze di DNA CLEAR e induce la sovraregolazione delle proteine ​​coinvolte nella biogenesi del lisosoma e nella via dell'autofagia. Mentre i fattori di trascrizione HIF1, ATF4, PPARa o NRF2 regolano positivamente anche l'autofagia, ZSCAN3, FXR, TCF4 o NFKB la regolano.

Riflettori puntati sulla mitofagia

I mitocondri sono organelli essenziali che forniscono energia cellulare e contribuiscono alla morte cellulare. Questo organello è continuamente esposto a minacce intra ed extra mitocondriali. Ad esempio, la fosforilazione ossidativa mitocondriale produce ATP e sottoprodotti come le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che possono causare danni al DNA mitocondriale. La rimozione dei mitocondri danneggiati è fondamentale per mantenere l'omeostasi cellulare e qui la mitofagia gioca un ruolo chiave nel garantire un processo di controllo selettivo per mantenere la qualità e la quantità dei mitocondri. La mitofagia è controllata da due proteine ​​principali: PINK1 (putative chinasi 1 indotta da PTEN) che è una serina/treonina-proteina chinasi e PARKIN che è una ligasi E3-ubiquitina. PINK1 è indirizzato ai mitocondri polarizzati sani attraverso una sequenza di targeting mitocondriale e viene elaborato dalle peptidasi di elaborazione della matrice (MPP) e dalla proteasi PARL nella membrana interna mitocondriale. La forma matura 52kD di PINK viene quindi rilasciata nel citosol, dove viene ubiquitinata e degradata dal proteasoma. Nei mitocondri depolarizzati danneggiati, PINK1 si accumula sulla membrana esterna mitocondriale nel complesso TOM (Translocase of the Outer Membrane). Dopo la sua autofosforilazione, PINK1 attivato a sua volta fosforila l'ubiquitina sulla serina 65 (Ser65) che promuove la stabilizzazione della parkina. In una conformazione attiva, PINK1 fosforila direttamente e attiva completamente Parkin. Una volta attivato, Parkin ubiquitina molti bersagli sulla membrana mitocondriale esterna (MOM), come la mitofusina (MNF), il VDAC o il fattore pro-apoptotico BAK, nonché le proteine ​​citosoliche. I substrati mitocondriali poliubiquitinati si legano agli adattatori LC3, come OPTN o NDP52, che sono fosforilati da TBK1. Infine, i mitocondri danneggiati sono intrappolati negli autofagosomi e ulteriormente degradati dagli enzimi lisosomiali. La figura 2 mostra i meccanismi nei mitocondri sani rispetto a quelli danneggiati in modo più dettagliato.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/TN%20Email%20Campaigns%20and%20App%20Alerts/Landing%20Page%20Promotions/TN_PerkinElmer_Autophagy_eBOOK.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1660566950782.1661004111073.98&__hssc=8807082.1.1661004111073&__hsfp=1418904915&hsCtaTracking=08f36d5a-c178-4aaa-8546-e0e9b7d49144%7C06cccf51-b0ee-45fd-8f4a-06040bf42e95