Cell engineering / Ingegneria cellulare
Cell engineering / Ingegneria cellulare
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Introduction
The next step in the development of an allogeneic-based CAR T cell therapy is engineering or making changes to the genetic makeup of the isolated T cells. These changes ultimately produce T cells that circumvent the lifethreatening issues of rejection. The changes also introduce the chimeric antigen receptor (CAR) that targets antigens on the surface of tumor cells. Numerous cell engineering approaches exist and this section will describe three gene editing tools currently used: zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN), and clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-associated protein 9 (CRISPR-Cas9). Several methods for delivering these tools to T cells, as well a general overview of the engineering workflow, will also be discussed. Knock-ins versus knockouts The design of the off-the-shelf or universal CAR T cells from third-party, allogeneic healthy donors uses gene editing tools to mutate specific genes by targeting changes in the DNA of the donor cells. These tools facilitate gene editing in allogeneic T cells in two ways
1. Knock-in—adds a gene of interest to achieve the desired function in cells (e.g., adding HLA-E to prevent host NK killing of the allogeneic CAR T cells)
2. Knockout—disrupts unwanted gene functions of the donor T cells, typically through deletions of genetic sequences (e.g., eliminating the TCR αβ chains of the TCR). To knock in or knock out genes, scientists usually rely on a DNA-specific endonuclease that is directed to a specific cut site using a “guide” protein or nucleic acid sequence. After the double-stranded DNA is cut, cellular repair mechanisms fix the cut region of the gene. These double-stranded DNA repairs can be completed via two mechanisms: nonhomologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR). The imprecise NHEJ is error prone and can lead to small insertions or deletions (indels) at the target site. If the NHEJ repair is made precisely in the coding region of the targeted gene, an indel or knockout of that gene will be produced (Figure 1). With HDR, a donor template sequence (e.g., HLA-E T cell engineering) flanked by the sequences homologous to those surrounding the cut site is added to the reaction for insertion via recombination. This desired sequence insertion results in a precise gene addition known as knock-in mutation.
Gene editing technologies used to create allogeneic T cells
Numerous approaches to targeted genome modification can generate these permanent mutations, but three gene editing tools have been well-studied for creating allogeneic CAR T cells with either a knockout TCR complex or knock-in HLA-E gene: ZFN, TALEN, and cluster regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-CRISPRassociated protein 9 (CRISPR-Cas9) (Figure 1).
ZFN
ZFN is a transcription factor that can be specially designed as an artificial endonuclease that cuts a specific sequence of double-stranded DNA. ZFN consists of two components: the first part is a zinc-bearing DNA-binding protein consisting of several zinc finger modules, which act as a guide to bind to a desired DNA sequence through DNAprotein interactions. The second part is the FokI nuclease, which is connected to the DNA-binding protein via a flexible peptide linker, and cuts the DNA creating a doublestranded break (Figure 1A). Each zinc finger module interacts with three consecutive nucleotides, so two zinc finger modules will interact with 6 consecutive nucleotides and so on. A fully functional zinc finger DNA-binding domain consists of a chain of 3–6 individual zinc finger modules that hybridize to a highly specific target binding site of 9–18 base pairs, which determines the specificity of the cut region of the DNA sequence. In practice, ZFNs are used as a pair with a right-hand and left-hand ZFN, and each FokI must be dimerized for it to function as a nuclease that can cut the desired double-stranded DNA region. A zinc finger DNA-binding protein can be designed to pair with a desired part of the genome, placing these DNA-binding proteins and the nuclease in the exact region to create the desired mutation or change. Designing ZFN is very time-consuming because the DNA-binding protein (a tertiary structure) needs to “fit” exactly to 3 consecutive nucleotides. This process takes twice as long because there is a left and right ZFN requirement. This strict requirement also makes ZFN a highly specific engineering tool that has very few off-target effects.
TALEN
TALEN is another specially designed DNA nuclease similar to ZFN. TALEN also has a DNA-binding protein (TALE) that is derived from Xanthamonas and a Fok1 nuclease as the cleavage domain. Also like ZFN, TALEN works as a pair of modules (i.e., a right-hand TALEN and left-hand TALEN) and the two FokI nucleases must be dimerized to form a functional nuclease that can cleave the targeted double-stranded DNA (Figure 1B). The DNA-binding guide component is 12–20 individual TALE repeats that are arranged in a chain, where binding to a single DNA base pair is based on the repeat variable di-residues (RVDs) at position 12 and 13 of each TALE unit. TALEN offers high target specificity because two TALEN complexes are required for DNA cleavage, but the final TALENs usually take four weeks to synthesize.
CRISPR-Cas9
More recently, CRISPR-Cas9 gene-editing technology derived from Streptococcus pyogenes has become available and is vastly different from both ZFN and TALEN gene-editing technologies. Similar to ZFN and TALEN, there is a desired number of approximately 20 base pairs for the target sequence. CRISPR-Cas9 technology consists of a nuclease component (Cas9) and an RNA component that acts as a guide (gRNA). Unlike ZFN and TALEN, which use proteinDNA interactions and require dimerization of the FokI nucleases for specific cleavage, the CRISPR-Cas9 system relies on RNA-DNA hybridization for target specificity. Another difference centers on acceptable target sites. The CRISPR-Cas9 target site for gene editing must have a protospacer adjacent motif (NGG; also known as a PAM site) in order for the gRNA to “locate” the specific DNA sequence, somewhat decreasing the flexibility of this system (Figure 1C). Despite this design drawback, CRISPR-Cas9 is highly efficient and takes less time to develop in comparison to TALEN and ZFN.
Summary of gene editing nuclease systems
The two genome editing technologies, ZFN and TALEN
(Figures 1A and 1B), are very specific gene-editing tools
because two DNA binding proteins linked to nucleases
(left- and right-handed complexes) must be designed
for each editing experiment. The genetic sequences for
these tools are transferred to a cell to be expressed into
functional nucleases. The genome editing technology, the
CRISPR-Cas9 system (Figure 1C), simply requires the in
vitro combination of the designed gRNA and the Cas9
protein to create a single CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein
(RNP) complex that can induce the double-stranded DNA
break once it is delivered into a cell. It summarizes
the three gene-editing technologies and offers examples of
their use for off-the-shelf CAR T cell generation.
Delivery systems for gene-editing tools
Delivery of gene-editing tools is challenging because these
tools are macromolecules. Unlike small molecule reagents
that can easily be dissolved in an aqueous solution and
enter the cells by diffusion, macromolecules need an
active delivery system to get into the cells. Currently
numerous delivery systems are available for in vivo and
in vitro gene-editing applications. These methods include
electroporation (EP) or nucleofection, lipid or polymer
nanoparticles, cell-penetrating peptides, and viral vectors
such as lentivirus, adenovirus, or adeno-associated virus
(AAV). The methods are based on one of three basic
principles that can facilitate gene-editing tool delivery into
the cells:
1. Charged-surface interaction—a positively charged particle binds to the negatively charged cell membrane and the cell takes up the particle
2. Application of an electrical current to the cells— the electrical current destabilizes the cell membrane, creating pores that allow particles to pass through
3. Viral vector systems—modified viruses that are not harmful to humans are used to infect cells and deliver cargo of interest
Here, we will discuss the most used delivery system of each method, and they are lipid-based transfection, electrical pulse-based transfection, and viral transduction.
Cationic lipid-based delivery system
This is the most economical and easiest method of delivery for gene-editing tools because this method does not require the use of special equipment or laboratory vessels. This approach relies on lipid molecules to form liposomes to encapsulate the gene-editing tool cargo, aiding transfection into cells. (e.g., Invitrogen™ Lipofectamine™ reagents). In this method, the positively charged lipid nanoparticle complex fuses with the negatively charged cell membranes, facilitating the delivery of the constructs into the cells through a process called endocytosis. The gene-editing tools are then released into the cytoplasm and ultimately enter the nucleus for gene editing to begin.
Electrical pulse-based delivery system
This method can be costly because it requires special equipment and cuvettes. The electrical pulse-based approach involves placing the cells in a cuvette, suspending the cells in conductive buffer, and briefly applying high voltage electrical pulses. The electricity creates temporary pores in the cell and nuclear membranes, which allow the delivery of macromolecules. There are two electrica pulse-based techniques, electroporation and nucleofection. These two techniques differ based on the devices used, parameter controls, types of buffer, and where the macromolecules are delivered into the subcellular space. An electroporation device (e.g., the Invitrogen Neon Transfection System) is an “open system”, allowing researchers to manually set the parameters for the optimization of each cell type. The gene-editing nuclease components are delivered into the cytoplasm and ultimately enter the nucleus of the cells. In contrast, a nucleofection device (e.g., the Nucleofector System) is a “closed system” because the electrical pulse parameters and propriety buffer solutions are preset for each cell type by the manufacturer. In this method, most of the gene-editing macromolecules are delivered directly into the nucleus.
Viral-based delivery system
Lentivirus, a single-stranded RNA virus, is a robust vector and one of the most used viral vectors for gene editing. Lentivirus is an excellent vector for both immunotherapy and gene therapy. Studies showed that lentiviral vectors can deliver various CAR constructs into immune cells, deliver gene-editing tools such as CRISPR-Cas 9 into target cells, or deliver a heathy gene to correct diseases such as sickle cell disease, severe combined immunodeficiency, and 18 β-thalassemia. Most noticeable, lentiviral vectors have been approved for the clinical application of delivering CAR constructs into T cells for CAR T therapies. The biggest advantage of lentiviral viral vectors is their high infection (or transduction) efficiency in both dividing and non-dividing cells. The vectors have good safety profiles, have a large carrying capacity, and can maintain long-term transgene expression. The large carrying capacity of single-design lentiviral vectors can deliver Cas9, sgRNA, and a puromycin selective marker into a target cell.
Overview of the gene-editing workflow
The complexity of generating engineered allogeneic T cells for CAR T therapy is quite formidable. With the help of gene editing, numerous immunological hurdles can be overcome to create an allogeneic T cell that will be accepted by the recipient patient without causing life threatening consequences. The workflow can be summarized as follows:
• Design and creation of chosen gene-editing nuclease
• Transfection of gene-editing tools into T cells
• Monitoring cleavage efficiency
• Analysis and validation of knock-ins and knockouts
A number of preparatory steps need to be performed before the actual engineering of the T cells, beginning with the choice and design of the nuclease components. Each of these gene-editing tools has its own rules and criteria for the design of the DNA binding domain; however, the final design for each relies heavily on the use of sequence analysis software tools to determine best sequences surrounding the targeted cut sites that limit undesirable or “off-target” binding sites. Free online software tools specifically developed for use in gene editing are available (e.g., Invitrogen™ TruDesign™ Genome Editor), and many gene-editing nuclease vendors offer design help. Once the design is finalized, the gene-editing nuclease components can take from 1–10 weeks to produce. Once T cells are isolated and activated from donors, the cells can be transfected with the chosen geneediting nuclease and engineered immediately, or if cell numbers are low, they can be expanded and engineered when sufficient cell numbers are reached. The cells can also be frozen and engineered at a later time. Every step in the gene-editing process needs to be confirmed before moving onto the next step. Typically, these steps can include: determining the efficiency of cleavage at the desired site, checking the sequence of PCR products, monitoring gene and protein expression, and checking the impacts (e.g., toxicity and viability) on the model cell system. Numerous reagents and flow cytometry systems are available to quantify TCR knockout efficiency.
Other cell sources for allogeneic CAR cell therapies
Several other cell sources exist that are compatible with generation of off-the-shelf CAR T cells such as embryonic stem cells (ESCs) and iPSCs. Both ESCs and iPSCs have the ability to self-renew, allowing potentially limitless in vitro expansion. Human ESCs are derived from embryos and therefore can be problematic for clinical development due to regulatory issues and limited sources. Human iPSCs, on the other hand, are derived from adult somatic cells. For example, fibroblasts can be reprogrammed in vitro, can be transformed into iPSC cells, and behave like embryonic pluripotent stem cells that can be differentiated into red blood cells, T cells, B cells, and NK cells with unlimited proliferation capacity.
Another iPSC-derived immune cell subset that is gaining momentum are NK cells, which comprise an important part of the innate immune response. NK cells are responsible for immune surveillance by targeting viral-infected cells and cancer cells that downregulate HLA I presentation and upregulate stress ligands. NK cells are interesting for CAR therapy since they do not have T cell receptors and cannot interact with HLA-I complex, which is the critical contributor to graft-vs.-host disease. Unlike iPSC-derived CAR T cells, which only kill tumor cells that express the specific antigen that the CAR recognizes, iPSC-derived CAR NK cells can kill both tumor cells that express the CAR antigen as well as tumor cells that do not express the CAR antigen (figure 1). Another attractive feature of using iPSC-derived CAR NK cells is their cytokine profile; upon activation they secrete a restricted level of IFN-γ, IL-12, and GM-CSF. CAR T cells secrete IL-1 and IL-6 continuously upon activation, and the presence of IL-1 and IL-6 can lead to cytokine-releasesyndrome (CRS), a serious adverse event seen in some patients receiving CAR T therapies. To date, adoptive transfer of iPSC-derived NK cells is well tolerated, and neither GvHD nor cytokine toxicity have been induced in patients.
Summary
There are a variety of gene-editing tools and delivery systems available to facilitate the genetic changes necessary for T cells to be used in CAR T therapies. Each system has its own advantages and disadvantages, which should be carefully weighed for each CAR T cell therapy. Tradeoffs such as target specificity versus ease of use or cost versus speed will need to be made. As with many cutting-edge technologies, the tools available are rapidly being improved, and new approaches are appearing to address the current limitations of the field.
ITALIANO
Introduzione
Il passo successivo nello sviluppo di una terapia con cellule CAR T a base allogenica è l'ingegneria o apportare modifiche alla composizione genetica delle cellule T isolate. Questi cambiamenti alla fine producono cellule T che aggirano i problemi mortali del rigetto. Le modifiche introducono anche il recettore chimerico dell'antigene (CAR) che prende di mira gli antigeni sulla superficie delle cellule tumorali. Esistono numerosi approcci di ingegneria cellulare e questa sezione descriverà tre strumenti di modifica genica attualmente utilizzati: nucleasi a dito di zinco (ZFN), nucleasi effettore simile all'attivatore della trascrizione (TALEN) e proteina 9 associata a ripetizione palindromica breve (CRISPR) (CRISPR) associata a cluster regolarmente interspaziati -Cas9). Verranno inoltre discussi diversi metodi per fornire questi strumenti ai linfociti T, nonché una panoramica generale del flusso di lavoro ingegneristico. Knock-in contro knockout La progettazione delle cellule T CAR standard o universali di donatori sani allogenici di terze parti utilizza strumenti di modifica genica per mutare geni specifici mirando ai cambiamenti nel DNA delle cellule donatrici. Questi strumenti facilitano l'editing genico nelle cellule T allogeniche in due modi
1. Knock-in: aggiunge un gene di interesse per ottenere la funzione desiderata nelle cellule (ad esempio, aggiungendo HLA-E per prevenire l'uccisione di NK dell'ospite delle cellule T CAR allogeniche)
2. Knockout: interrompe le funzioni geniche indesiderate dei linfociti T del donatore, tipicamente attraverso l'eliminazione di sequenze genetiche (ad esempio, eliminando le catene TCR αβ del TCR). Per knock-in o knock out geni, gli scienziati di solito si affidano a un'endonucleasi specifica del DNA che viene diretta a un sito di taglio specifico utilizzando una sequenza proteica o di acido nucleico "guida". Dopo che il DNA a doppio filamento è stato tagliato, i meccanismi di riparazione cellulare fissano la regione tagliata del gene. Queste riparazioni del DNA a doppio filamento possono essere completate tramite due meccanismi: giunzione dell'estremità non omologa (NHEJ) o riparazione diretta dall'omologia (HDR). L'impreciso NHEJ è soggetto a errori e può portare a piccoli inserimenti o eliminazioni (indel) nel sito di destinazione. Se la riparazione NHEJ viene eseguita precisamente nella regione codificante del gene mirato, verrà prodotto un indel o knockout di quel gene (Figura 1). Con l'HDR, alla reazione per l'inserimento tramite ricombinazione viene aggiunta una sequenza del modello del donatore (ad esempio, ingegneria delle cellule T HLA-E) affiancata dalle sequenze omologhe a quelle che circondano il sito di taglio. Questo inserimento di sequenza desiderato si traduce in una precisa aggiunta genica nota come mutazione knock-in.
Tecnologie di editing genetico utilizzate per creare cellule T allogeniche
Numerosi approcci alla modifica mirata del genoma possono generare queste mutazioni permanenti, ma tre strumenti di modifica genica sono stati ben studiati per creare cellule T CAR allogeniche con un complesso TCR knockout o un gene HLA-E knock-in: ZFN, TALEN e cluster regolarmente ripetizione palindromica breve interspaziata (CRISPR)-proteina associata a CRISPR 9 (CRISPR-Cas9) (Figura 1).
ZFN
ZFN è un fattore di trascrizione che può essere appositamente progettato come endonucleasi artificiale che taglia una sequenza specifica di DNA a doppio filamento. ZFN è costituito da due componenti: la prima parte è una proteina legante il DNA contenente zinco costituita da diversi moduli a dita di zinco, che fungono da guida per legarsi a una sequenza di DNA desiderata attraverso le interazioni della DNAproteina. La seconda parte è la nucleasi FokI, che è collegata alla proteina legante il DNA tramite un linker peptidico flessibile e taglia il DNA creando una rottura a doppio filamento (Figura 1A). Ciascun modulo zinc finger interagisce con tre nucleotidi consecutivi, quindi due moduli zinc finger interagiranno con 6 nucleotidi consecutivi e così via. Un dominio di legame del DNA a dita di zinco completamente funzionale è costituito da una catena di 3-6 moduli di dita di zinco individuali che si ibridano in un sito di legame target altamente specifico di 9-18 coppie di basi, che determina la specificità della regione tagliata della sequenza di DNA. In pratica, gli ZFN vengono utilizzati in coppia con uno ZFN destro e uno sinistro e ciascun FokI deve essere dimerizzato affinché funzioni come una nucleasi in grado di tagliare la regione del DNA a doppio filamento desiderata. Una proteina legante il DNA a dito di zinco può essere progettata per accoppiarsi con una parte desiderata del genoma, posizionando queste proteine leganti il DNA e la nucleasi nella regione esatta per creare la mutazione o il cambiamento desiderati. La progettazione di ZFN richiede molto tempo perché la proteina legante il DNA (una struttura terziaria) deve "adattarsi" esattamente a 3 nucleotidi consecutivi. Questo processo richiede il doppio del tempo perché esiste un requisito ZFN sinistro e destro. Questo severo requisito rende ZFN uno strumento di ingegneria altamente specifico che ha pochissimi effetti fuori bersaglio.
TALEN
TALEN è un'altra DNA nucleasi appositamente progettata simile a ZFN. TALEN ha anche una proteina legante il DNA (TALE) che è derivata da Xanthamonas ed una nucleasi Fok1 come dominio di scissione. Anche come ZFN, TALEN funziona come una coppia di moduli (cioè un TALEN di destra e TALEN di sinistra) e le due nucleasi FokI devono essere dimerizzate per formare una nucleasi funzionale che può scindere il DNA a doppio filamento mirato (Figura 1B ). Il componente guida per il legame del DNA è costituito da 12-20 ripetizioni TALE individuali disposte in una catena, in cui il legame a una singola coppia di basi del DNA si basa sui residui variabili di ripetizione (RVD) nelle posizioni 12 e 13 di ciascuna unità TALEN. TALEN offre un'elevata specificità del bersaglio perché sono necessari due complessi TALEN per la scissione del DNA, ma i TALEN finali di solito richiedono quattro settimane per essere sintetizzati.
CRISPR-Cas9
Più recentemente, la tecnologia di modifica genetica CRISPR-Cas9 derivata da Streptococcus pyogenes è diventata disponibile ed è molto diversa dalle tecnologie di modifica genetica ZFN e TALEN. Simile a ZFN e TALEN, esiste un numero desiderato di circa 20 coppie di basi per la sequenza target. La tecnologia CRISPR-Cas9 consiste in un componente nucleasico (Cas9) e un componente RNA che funge da guida (gRNA). A differenza di ZFN e TALEN, che utilizzano interazioni proteinDNA e richiedono la dimerizzazione delle nucleasi FokI per la scissione specifica, il sistema CRISPR-Cas9 si basa sull'ibridazione RNA-DNA per la specificità del bersaglio. Un'altra differenza riguarda i siti di destinazione accettabili. Il sito target CRISPR-Cas9 per l'editing genetico deve avere un motivo adiacente protospacer (NGG; noto anche come sito PAM) affinché il gRNA "individui" la sequenza specifica del DNA, diminuendo in qualche modo la flessibilità di questo sistema (Figura 1C) . Nonostante questo inconveniente di progettazione, CRISPR-Cas9 è altamente efficiente e richiede meno tempo per svilupparsi rispetto a TALEN e ZFN.
Riepilogo dei sistemi nucleasici di editing genetico
Le due tecnologie di editing del genoma, ZFN e TALEN (Figure 1A e 1B), sono strumenti di editing genetico molto specifici perché per ogni esperimento di editing devono essere progettate due proteine leganti il DNA legate alle nucleasi (complessi sinistrorsi e destrorsi). Le sequenze genetiche di questi strumenti vengono trasferite in una cellula per essere espresse in nucleasi funzionali. La tecnologia di modifica del genoma, il sistema CRISPR-Cas9 (Figura 1C), richiede semplicemente la combinazione in vitro del gRNA progettato e della proteina Cas9 per creare un singolo complesso di ribonucleoproteina CRISPR-Cas9 (RNP) che può indurre la rottura del DNA a doppio filamento una volta consegnato in una cella. Riassume le tre tecnologie di modifica genetica e offre esempi del loro utilizzo per la generazione di cellule T CAR standard. Sistemi di consegna per strumenti di modifica genetica La consegna di strumenti di modifica genetica è impegnativa perché questi strumenti sono macromolecole. A differenza dei reagenti a piccole molecole che possono essere facilmente disciolti in una soluzione acquosa ed entrare nelle cellule per diffusione, le macromolecole necessitano di un sistema di rilascio attivo per entrare nelle cellule. Attualmente sono disponibili numerosi sistemi di consegna per applicazioni di modifica genetica in vivo e in vitro. Questi metodi includono elettroporazione (EP) o nucleofezione, nanoparticelle lipidiche o polimeriche, peptidi che penetrano nelle cellule e vettori virali come lentivirus, adenovirus o virus adeno-associati (AAV). I metodi si basano su uno dei tre principi di base che possono facilitare la consegna di strumenti di modifica genetica nelle cellule:
1. Interazione superficie carica: una particella caricata positivamente si lega alla membrana cellulare caricata negativamente e la cellula assorbe la particella
2. Applicazione di una corrente elettrica alle cellule: la corrente elettrica destabilizza la membrana cellulare, creando pori che consentono alle particelle di passare attraverso
3. Sistemi vettoriali virali: i virus modificati che non sono dannosi per l'uomo vengono utilizzati per infettare le cellule e fornire il carico di interesse
Qui, discuteremo il sistema di consegna più utilizzato di ciascun metodo e sono la trasfezione basata sui lipidi, la trasfezione basata sull'impulso elettrico e la trasduzione virale.
Sistema di rilascio a base di lipidi cationici
Questo è il metodo di consegna più economico e semplice per gli strumenti di editing genetico perché questo metodo non richiede l'uso di attrezzature speciali o recipienti di laboratorio. Questo approccio si basa su molecole lipidiche per formare liposomi per incapsulare il carico dello strumento di modifica genetica, favorendo la trasfezione nelle cellule. (ad es. reagenti Invitrogen™ Lipofectamine™). In questo metodo, il complesso di nanoparticelle lipidiche caricato positivamente si fonde con le membrane cellulari caricate negativamente, facilitando la consegna dei costrutti nelle cellule attraverso un processo chiamato endocitosi. Gli strumenti di modifica genetica vengono quindi rilasciati nel citoplasma e alla fine entrano nel nucleo per iniziare la modifica genetica.
Sistema di erogazione basato su impulsi elettrici
Questo metodo può essere costoso perché richiede attrezzature e cuvette speciali. L'approccio basato sugli impulsi elettrici prevede il posizionamento delle cellule in una cuvetta, la sospensione delle cellule in un buffer conduttivo e l'applicazione brevemente di impulsi elettrici ad alta tensione. L'elettricità crea pori temporanei nella cellula e nelle membrane nucleari, che consentono il rilascio di macromolecole. Esistono due tecniche basate sull'impulso elettrico, l'elettroporazione e la nucleofezione. Queste due tecniche differiscono in base ai dispositivi utilizzati, ai controlli dei parametri, ai tipi di buffer e al punto in cui le macromolecole vengono consegnate nello spazio subcellulare. Un dispositivo di elettroporazione (ad esempio, l'Invitrogen Neon Transfection System) è un "sistema aperto", che consente ai ricercatori di impostare manualmente i parametri per l'ottimizzazione di ciascun tipo di cellula. I componenti della nucleasi che modificano i geni vengono consegnati nel citoplasma e infine entrano nel nucleo delle cellule. Al contrario, un dispositivo di nucleofezione (ad esempio, il Nucleofector System) è un "sistema chiuso" perché i parametri dell'impulso elettrico e le soluzioni tampone di proprietà sono preimpostati dal produttore per ciascun tipo di cellula. In questo metodo, la maggior parte delle macromolecole che modificano i geni vengono consegnate direttamente nel nucleo.
Sistema di somministrazione a base virale
Il lentivirus, un virus a RNA a filamento singolo, è un vettore robusto e uno dei vettori virali più utilizzati per l'editing genetico. Il lentivirus è un vettore eccellente sia per l'immunoterapia che per la terapia genica. Gli studi hanno dimostrato che i vettori lentivirali possono fornire vari costrutti CAR nelle cellule immunitarie, fornire strumenti di modifica genetica come CRISPR-Cas 9 nelle cellule bersaglio o fornire un gene sano per correggere malattie come l'anemia falciforme, grave immunodeficienza combinata e 18 β -talassemia. I vettori lentivirali più evidenti sono stati approvati per l'applicazione clinica della somministrazione di costrutti CAR nelle cellule T per le terapie CAR T. Il più grande vantaggio dei vettori virali lentivirali è la loro elevata efficienza di infezione (o trasduzione) sia nelle cellule in divisione che in quelle non in divisione. I vettori hanno buoni profili di sicurezza, hanno una grande capacità di carico e possono mantenere l'espressione del transgene a lungo termine. La grande capacità di carico dei vettori lentivirali a disegno singolo può fornire Cas9, sgRNA e un marcatore selettivo di puromicina in una cellula bersaglio.
Panoramica del flusso di lavoro di modifica genetica
La complessità della generazione di cellule T allogeniche ingegnerizzate per la terapia CAR T è piuttosto formidabile. Con l'aiuto dell'editing genetico, numerosi ostacoli immunologici possono essere superati per creare una cellula T allogenica che sarà accettata dal paziente ricevente senza causare conseguenze pericolose per la vita. Il flusso di lavoro può essere riassunto come segue:
• Progettazione e creazione della nucleasi scelta per l'editing genetico
• Trasfezione di strumenti di editing genetico in cellule T
• Monitoraggio dell'efficienza della scissione
• Analisi e validazione di knock-in e knockout
È necessario eseguire una serie di passaggi preparatori prima dell'effettiva ingegnerizzazione dei linfociti T, a cominciare dalla scelta e dalla progettazione dei componenti della nucleasi. Ciascuno di questi strumenti di modifica genetica ha le proprie regole e criteri per la progettazione del dominio di legame del DNA; tuttavia, il progetto finale di ciascuno si basa fortemente sull'uso di strumenti software di analisi delle sequenze per determinare le migliori sequenze che circondano i siti di taglio mirati che limitano i siti di legame indesiderati o "fuori bersaglio". Sono disponibili strumenti software online gratuiti sviluppati specificamente per l'uso nell'editing genetico (ad es. Invitrogen™ TruDesign™ Genome Editor) e molti fornitori di nucleasi per l'editing genetico offrono assistenza alla progettazione. Una volta finalizzato il progetto, la produzione dei componenti della nucleasi che modifica il gene può richiedere da 1 a 10 settimane. Una volta che le cellule T sono isolate e attivate dai donatori, le cellule possono essere trasfettate con la nucleasi geneediting scelta e ingegnerizzate immediatamente, oppure se il numero di cellule è basso, possono essere espanse e ingegnerizzate quando viene raggiunto un numero sufficiente di cellule. Le cellule possono anche essere congelate e ingegnerizzate in un secondo momento. Ogni fase del processo di modifica genetica deve essere confermata prima di passare alla fase successiva. Tipicamente, questi passaggi possono includere: determinare l'efficienza della scissione nel sito desiderato, controllare la sequenza dei prodotti della PCR, monitorare l'espressione genica e proteica e controllare gli impatti (ad esempio, tossicità e vitalità) sul sistema cellulare modello. Sono disponibili numerosi reagenti e sistemi di citometria a flusso per quantificare l'efficienza del knockout del TCR.
Altre fonti cellulari per terapie cellulari CAR allogeniche
Esistono diverse altre fonti cellulari compatibili con la generazione di cellule T CAR standard come le cellule staminali embrionali (ESC) e le iPSC. Sia gli ESC che gli iPSC hanno la capacità di autorinnovarsi, consentendo un'espansione in vitro potenzialmente illimitata. Gli ESC umani derivano da embrioni e quindi possono essere problematici per lo sviluppo clinico a causa di problemi normativi e fonti limitate. Le iPSC umane, d'altra parte, sono derivate da cellule somatiche adulte. Ad esempio, i fibroblasti possono essere riprogrammati in vitro, trasformati in cellule iPSC e si comportano come cellule staminali pluripotenti embrionali che possono essere differenziate in globuli rossi, cellule T, cellule B e cellule NK con capacità di proliferazione illimitata.
Un altro sottoinsieme di cellule immunitarie derivate da iPSC che sta guadagnando slancio sono le cellule NK, che costituiscono una parte importante della risposta immunitaria innata. Le cellule NK sono responsabili della sorveglianza immunitaria prendendo di mira le cellule infette da virus e le cellule tumorali che sottoregolano la presentazione dell'HLA I e sovraregolano i ligandi dello stress. Le cellule NK sono interessanti per la terapia CAR poiché non hanno recettori delle cellule T e non possono interagire con il complesso HLA-I, che è il contributo critico alla malattia del trapianto contro l'ospite. A differenza delle cellule CAR T derivate da iPSC, che uccidono solo le cellule tumorali che esprimono l'antigene specifico che la CAR riconosce, le cellule NK CAR derivate da iPSC possono uccidere sia le cellule tumorali che esprimono l'antigene CAR sia le cellule tumorali che non esprimono la CAR antigene (Figura 2). Un'altra caratteristica interessante dell'utilizzo di cellule NK CAR derivate da iPSC è il loro profilo di citochine; dopo l'attivazione secernono un livello limitato di IFN-γ, IL-12 e GM-CSF. Le cellule CAR T secernono IL-1 e IL-6 continuamente dopo l'attivazione e la presenza di IL-1 e IL-6 può portare alla sindrome da rilascio di citochine (CRS), un grave evento avverso osservato in alcuni pazienti che ricevono terapie CAR T. Ad oggi, il trasferimento adottivo di cellule NK derivate da iPSC è ben tollerato e nei pazienti non sono state indotte né GvHD né tossicità da citochine.
Riepilogo
Sono disponibili una varietà di strumenti di modifica genetica e sistemi di rilascio per facilitare i cambiamenti genetici necessari per l'utilizzo delle cellule T nelle terapie CAR T. Ogni sistema ha i suoi vantaggi e svantaggi, che dovrebbero essere attentamente valutati per ogni terapia con cellule CAR T. Dovranno essere fatti compromessi come la specificità dell'obiettivo rispetto alla facilità d'uso o il costo rispetto alla velocità. Come per molte tecnologie all'avanguardia, gli strumenti disponibili vengono rapidamente migliorati e sembrano apparire nuovi approcci per affrontare gli attuali limiti del settore.
Da:
https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Thermo/Mariskka/2022%20SQL%20Campaign/cell-therapy-handbook-thermo-fisher-1.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1662136971846.1662227813798.105&__hssc=8807082.1.1662227813798&__hsfp=1418904915&hsCtaTracking=5ecb48c7-b247-4faf-be12-b0ce69caca78%7Ce6d6986c-d41a-473f-ba60-61a59c5d0605
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