Cell isolation / Isolamento cellulare

 Cell isolation / Isolamento cellulare

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Closed counterflow centrifugation system versus open density gradient system for isolation of PBMCs from red blood cells. Fluid from a single-donor leukopak was divided in half, and PBMCs were separated using (A) density gradient centrifugation using Ficoll polymer or (B) counterflow centrifugation using the CTS Rotea system. The CTS Rotea system can isolate PBMCs from a leukopak in less than 30 minutes, with nearly equivalent performance to the density gradient system and the added benefit of closed processing. / Sistema di centrifugazione in controcorrente chiuso rispetto al sistema a gradiente di densità aperto per l'isolamento di PBMC dai globuli rossi. Il fluido di un leukopak a donatore singolo è stato diviso a metà e i PBMC sono stati separati utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità (A) utilizzando il polimero Ficoll o la centrifugazione in controcorrente (B) utilizzando il sistema CTS Rotea. Il sistema CTS Rotea può isolare i PBMC da un leukopak in meno di 30 minuti, con prestazioni quasi equivalenti al sistema a gradiente di densità e l'ulteriore vantaggio dell'elaborazione chiusa.

Introduction

 At the foundation of any cell therapy development and manufacturing workflow, the quality of the starting cellular material directly impacts the final product’s viability and the efficacy of patient treatment. Most cell isolation methods, specifically peripheral blood mononuclear cell (PBMC) isolations, are currently performed using open systems, which can contribute to errors and contamination, resulting in the failure to produce a viable cell therapy. Additionally, donor product variability can lead to differences in cell composition, cell viability, and sensitivity during the expansion stages of the manufacturing process. For a multitude of reasons, not all patients, including healthy donors, are able to effectively mobilize functional T cells at the desired numbers suitable for the process. Therefore, T cell isolation workflows must be flexible to allow for various modifications, while still yielding a standardized CAR T cell product, regardless of the input material harvest from the patient or donor. The ideal isolation workflow would also be automated, closed, and consistent. This section will discuss the isolation of PBMCs and selection and activation of the T cell populations (CD3+) to be engineered. This section will also discuss alternative cell approaches using induced pluripotent stem cell (iPSC)- derived cells and NK cells, which are potential solutions to overcome issues with the more traditional approach. 

Healthy donor characteristics 

The development of an allogeneic cell therapy begins with the isolation of T cells from donated blood in a process known as leukapheresis. To go to a clinical trial, a sufficient amount of donated blood is needed with the correct cell composition and phenotypes. For an allogeneic therapy, the ideal donor blood is preferably from a young individual. The donated blood composition should have a low percentage of monocytes and neutrophils (specifically granulocytes), and cells should demonstrate an efficient doubling time. The donor blood should have an immunological profile consisting of a normal CD3+ cell number, a balanced CD4/CD8 ratio, a sufficient number of stem memory cells, and expression of CD62L+CCR7+ T cells. As expected, cell therapy developers and manufacturers want the highest purity of T cell population possible and sometimes look for specific subsets of T cells. Poor quality starting material may result in an inability to use it for cell therapy processing and ultimately, failure of the donor product reaching the clinic. However, efficient cell isolation methods that are reliable with high yields and purity can alleviate the pressure on the quality of donor blood.

PBMC isolation 

Once donated blood is obtained and characterized, the next step is to isolate PBMCs. Typically, the isolation methods are characterized as either open or closed, depending on the amount of direct user interaction needed. Closed methods are preferred because of a decreased risk for contamination and user error, and for some clinical applications, might be required. The most well-known practice to isolate PBMCs relies on density gradient centrifugation using Ficoll medium. Although this method successfully isolates PBMCs from red blood cells, the isolated PBMCs retain contaminants such as granulocytes, monocytes, and even some residual red blood cells. Most density gradient centrifugation isolations are performed using an open system, which makes the procedure prone to errors, contamination, and user-to-user variability. While automated closed systems for density gradient centrifugations exist, these systems tend to lose cells, lowering yields due to the lack of system flexibility and can be significantly more expensive. A more recent closed system approach relies on counterflow centrifugation, which separates cells based on their size and density. Systems using this technology (e.g., Gibco™ CTS™ Rotea™ system) suspend cells in a fluidized bed by exerting a constant flow force against centrifugal forces. The suspended cells are gently concentrated without forming a pellet and then washed with very high recoveries. Using elutriation, dead cells can be removed to optimize viability of the population. Adjustments to centrifugal speed and flow rate allow for cells to be fractionated based on size and density, with minimal shear

T cell isolation and activation 

Following PBMC isolation, the next step in the process is the isolation of T cells to remove any lingering contamination of other cell types and to improve product specificity. This is then followed by activation. The inherent variability with allogeneic donor blood leads to an inability to differentiate between cell types. To overcome this problem, magnetic bead-based approaches for selection of T cell populations have been developed. These approaches use magnetic beads conjugated to antibodies that recognize T cell surface markers and bind to them. When placed in close proximity to a magnet, the bead-T cell complex binds and is held while unwanted cell types can then be washed away. Once isolated, the T cells can be released from the beads. Several magnetic bead products are commercially available. Some of these platforms can be used for very specific cell populations (e.g., CD4/CD8+ or CD62L+), which are activated later through other means. Another system, Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28, provides both the primary and co-stimulatory signals required for activation and expansion of T cells, eliminating the need for a separate activation step and reducing the potential to introduce contamination.

iPSC-derived CAR NK cells One major issue with allogeneic workflows is insufficient cell numbers or starting material to create a product for patient infusion. To overcome this limitation, a revolutionary approach has been developed to derive NK cells or T cells from iPSCs. The use of NK cells reduces rejection barriers (e.g., graft-vs.-host disease) and NK cells can be generated from several different sources such as umbilical cord blood, bone-marrow, human embryonic stem cells, and iPSCs. A significant advantage of NK cells is that unlike T cells, they exhibit improved survival after killing multiple target cells. NK cells also produce a different profile of cytokines than T cells. The cytokines produced by T cells cause cytokine release syndrome (CRS), a life-threatening condition that has been observed in some patients using an adoptive cell therapy, and this can potentially be avoided with the use of NK cells. The most common cause of allogeneic therapy rejection is due to differences in the HLA class I gene of iPSC-derived products, resulting in a mismatch between the donor and recipient. T cells regularly interact with HLA complexes, thus any changes to the HLA complex on the surface would be an indication that the substance is foreign. Conversely, NK cells can exhibit cytotoxicity toward different tumor targets in an HLA-independent manner, which could mitigate the mismatch between donor and recipient. The isolation of primary NK cells is difficult and complex and can lead to low yields, making iPSC-derived CAR NK cells a more attractive choice for allogeneic workflows. To this end, the main goal is to identify an iPSC line(s) that can avoid allogeneic rejection and reduce the time to move cell therapies into the clinic.

Summary

Preparation of allogeneic CAR T cells requires identification of healthy third-party donors and isolation of a sufficient number of T cells for the subsequent engineering steps. Ideally, isolation would be performed in a closed system environment that can provide flexibility for modifications to easily account for differences in source material. Recent advancements have investigated use of other sources or cell types (i.e., iSPC-derived NK cells) to further expand and improve the use of the CAR technology.

ITALIANO

Introduzione

Alla base di qualsiasi flusso di lavoro di sviluppo e produzione di terapia cellulare, la qualità del materiale cellulare di partenza ha un impatto diretto sulla fattibilità del prodotto finale e sull'efficacia del trattamento del paziente. La maggior parte dei metodi di isolamento cellulare, in particolare gli isolamenti di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), vengono attualmente eseguiti utilizzando sistemi aperti, che possono contribuire a errori e contaminazione, con conseguente incapacità di produrre una terapia cellulare praticabile. Inoltre, la variabilità del prodotto del donatore può portare a differenze nella composizione cellulare, nella vitalità cellulare e nella sensibilità durante le fasi di espansione del processo di produzione. Per una moltitudine di ragioni, non tutti i pazienti, compresi i donatori sani, sono in grado di mobilitare efficacemente le cellule T funzionali al numero desiderato adatto per il processo. Pertanto, i flussi di lavoro di isolamento delle cellule T devono essere flessibili per consentire varie modifiche, pur continuando a produrre un prodotto a cellule T CAR standardizzato, indipendentemente dal raccolto di materiale in ingresso dal paziente o dal donatore. Il flusso di lavoro di isolamento ideale sarebbe anche automatizzato, chiuso e coerente. Questa sezione discuterà l'isolamento delle PBMC e la selezione e l'attivazione delle popolazioni di cellule T (CD3+) da ingegnerizzare. Questa sezione discuterà anche approcci cellulari alternativi che utilizzano cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e cellule NK, che sono potenziali soluzioni per superare i problemi con l'approccio più tradizionale.

Caratteristiche sane del donatore

Lo sviluppo di una terapia cellulare allogenica inizia con l'isolamento dei linfociti T dal sangue donato in un processo noto come leucaferesi. Per andare ad una sperimentazione clinica, è necessaria una quantità sufficiente di sangue donato con la composizione cellulare ed i fenotipi corretti. Per una terapia allogenica, il sangue donatore ideale è preferibilmente da un individuo giovane. La composizione del sangue donato dovrebbe avere una bassa percentuale di monociti e neutrofili (in particolare granulociti) e le cellule dovrebbero dimostrare un tempo di raddoppio efficiente. Il sangue del donatore dovrebbe avere un profilo immunologico costituito da un numero di cellule CD3+ normale, un rapporto CD4/CD8 bilanciato, un numero sufficiente di cellule della memoria staminali e l'espressione di cellule T CD62L+CCR7+. Come previsto, gli sviluppatori ed i produttori di terapie cellulari desiderano la massima purezza possibile della popolazione di cellule T e talvolta cercano sottoinsiemi specifici di cellule T. Un materiale di partenza di scarsa qualità può comportare l'impossibilità di utilizzarlo per l'elaborazione della terapia cellulare e, in definitiva, il mancato raggiungimento del prodotto del donatore in clinica. Tuttavia, metodi di isolamento cellulare efficienti, affidabili con rese e purezza elevate possono alleviare la pressione sulla qualità del sangue del donatore.

Isolamento PBMC

Una volta ottenuto e caratterizzato il sangue donato, il passaggio successivo consiste nell'isolare i PBMC. Tipicamente, i metodi di isolamento sono caratterizzati come aperti o chiusi, a seconda della quantità di interazione diretta dell'utente necessaria. I metodi chiusi sono preferiti a causa di un ridotto rischio di contaminazione ed errore dell'utente e per alcune applicazioni cliniche potrebbero essere necessari. La pratica più nota per isolare le PBMC si basa sulla centrifugazione in gradiente di densità utilizzando il mezzo Ficoll. Sebbene questo metodo isoli con successo i PBMC dai globuli rossi, i PBMC isolati trattengono contaminanti come granulociti, monociti e persino alcuni globuli rossi residui. La maggior parte degli isolamenti di centrifugazione in gradiente di densità vengono eseguiti utilizzando un sistema aperto, che rende la procedura soggetta ad errori, contaminazione e variabilità da utente ad utente. Sebbene esistano sistemi chiusi automatizzati per centrifugazioni in gradiente di densità, questi sistemi tendono a perdere cellule, riducendo i rendimenti a causa della mancanza di flessibilità del sistema e possono essere significativamente più costosi. Un approccio di sistema chiuso più recente si basa sulla centrifugazione in controcorrente, che separa le cellule in base alla loro dimensione e densità. I sistemi che utilizzano questa tecnologia (ad esempio, il sistema Gibco™ CTS™ Rotea™) sospendono le cellule in un letto fluido esercitando una forza di flusso costante contro le forze centrifughe. Le cellule sospese vengono concentrate delicatamente senza formare pellet e quindi lavate con recuperi molto elevati. Utilizzando l'elutriazione, le cellule morte possono essere rimosse per ottimizzare la vitalità della popolazione. Le regolazioni della velocità centrifuga e della portata consentono di frazionare le cellule in base alle dimensioni e alla densità, con un taglio minimo

Isolamento e attivazione dei linfociti T

Dopo l'isolamento del PBMC, il passaggio successivo del processo è l'isolamento dei linfociti T per rimuovere qualsiasi contaminazione persistente di altri tipi di cellule e migliorare la specificità del prodotto. Segue quindi l'attivazione. La variabilità intrinseca con il sangue del donatore allogenico porta all'incapacità di differenziare tra i tipi cellulari. Per superare questo problema, sono stati sviluppati approcci basati su perline magnetiche per la selezione delle popolazioni di cellule T. Questi approcci utilizzano perline magnetiche coniugate ad anticorpi che riconoscono i marcatori di superficie delle cellule T e si legano ad essi. Quando viene posizionato in prossimità di un magnete, il complesso di cellule T tallone si lega e viene trattenuto mentre i tipi di cellule indesiderati possono quindi essere lavati via. Una volta isolate, le cellule T possono essere rilasciate dalle perline. Sono disponibili in commercio diversi prodotti con perline magnetiche. Alcune di queste piattaforme possono essere utilizzate per popolazioni cellulari molto specifiche (ad es. CD4/CD8+ o CD62L+), che vengono attivate successivamente con altri mezzi. Un altro sistema, Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28, fornisce i segnali primari e co-stimolatori necessari per l'attivazione e l'espansione dei linfociti T, eliminando la necessità di una fase di attivazione separata e riducendo la possibilità di introdurre contaminazione.

Cellule CAR NK derivate da iPSC 

Uno dei problemi principali dei flussi di lavoro allogenici è il numero di cellule od il materiale di partenza insufficienti per creare un prodotto per l'infusione del paziente. Per superare questa limitazione, è stato sviluppato un approccio rivoluzionario per derivare cellule NK o cellule T da iPSC. L'uso di cellule NK riduce le barriere di rigetto (ad es. Malattia del trapianto contro l'ospite) e le cellule NK possono essere generate da diverse fonti come sangue del cordone ombelicale, midollo osseo, cellule staminali embrionali umane e iPSC. Un vantaggio significativo delle cellule NK è che, a differenza delle cellule T, mostrano una migliore sopravvivenza dopo aver ucciso più cellule bersaglio. Le cellule NK producono anche un diverso profilo di citochine rispetto alle cellule T. Le citochine prodotte dai linfociti T causano la sindrome da rilascio di citochine (CRS), una condizione pericolosa per la vita che è stata osservata in alcuni pazienti che utilizzano una terapia cellulare adottiva e che può essere potenzialmente evitata con l'uso di cellule NK. La causa più comune di rigetto della terapia allogenica è dovuta alle differenze nel gene HLA di classe I dei prodotti derivati ​​da iPSC, con conseguente discrepanza tra donatore e ricevente. Le cellule T interagiscono regolarmente con i complessi HLA, quindi qualsiasi modifica al complesso HLA sulla superficie indicherebbe che la sostanza è estranea. Al contrario, le cellule NK possono mostrare citotossicità verso diversi bersagli tumorali in modo indipendente dall'HLA, il che potrebbe mitigare la discrepanza tra donatore e ricevente. L'isolamento delle cellule NK primarie è difficile e complesso e può portare a basse rese, rendendo le cellule NK CAR derivate da iPSC una scelta più interessante per i flussi di lavoro allogenici. A tal fine, l'obiettivo principale è identificare una o più linee iPSC in grado di evitare il rigetto allogenico e ridurre i tempi di trasferimento delle terapie cellulari nella clinica.

Riepilogo

La preparazione di cellule T CAR allogeniche richiede l'identificazione di donatori sani di terze parti e l'isolamento di un numero sufficiente di cellule T per le successive fasi di progettazione. Idealmente, l'isolamento dovrebbe essere eseguito in un ambiente di sistema chiuso che può fornire flessibilità per le modifiche per tenere facilmente conto delle differenze nel materiale di partenza. I recenti progressi hanno studiato l'uso di altre fonti o tipi di cellule (cioè, cellule NK derivate da iSPC) per espandere e migliorare ulteriormente l'uso della tecnologia CAR.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Thermo/Mariskka/2022%20SQL%20Campaign/cell-therapy-handbook-thermo-fisher-1.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1662136971846.1662227813798.105&__hssc=8807082.1.1662227813798&__hsfp=1418904915&hsCtaTracking=5ecb48c7-b247-4faf-be12-b0ce69caca78%7Ce6d6986c-d41a-473f-ba60-61a59c5d0605