EVALUATION OF HISTAMINE LEVEL IN MOUSE LUNG LAVAGE FLUID / VALUTAZIONE DEL LIVELLO DI ISTAMINA NEL FLUIDO DI LAVAGGIO DEL POLMONE DEL TOPO
EVALUATION OF HISTAMINE LEVEL IN MOUSE LUNG LAVAGE FLUID / VALUTAZIONE DEL LIVELLO DI ISTAMINA NEL FLUIDO DI LAVAGGIO DEL POLMONE DEL TOPO
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
CONTEXT
Histamine is an organic compound that plays a major role in the development of many allergic diseases. Mast cells are multifunctional bone marrow-derived tissue-dwelling cells that are responsible for a major part of histamine production in the body. Most allergic diseases are triggered by the interaction between an allergen and allergen-specific antibodies present on the membrane of mast cells and basophils. This interaction leads to the degranulation of these cells, which in turn provokes the release of many allergic and inflammatory biomarkers, including leukotrienes and histamine. Leukotrienes are inflammatory mediators produced in leukocytes from arachidonic acid by the enzyme 5-lipoxygenase (5-LO). For example in asthma, both the release of cysteinylleukotrienes and the release of histamine from degranulating mast cells are responsible for the narrowing of airways that happens during asthma attacks. However, currently, there are no approved anti-asthma drugs that can simultaneously inhibit the biosynthesis of leukotrienes – by blocking the activity of the 5-LO enzyme - and mast cell degranulation. The only 5-LO inhibitor approved for the treatment of asthma, Zileuton, has limited efficacy which might be linked to its inability to affect mast cell degranulation. Consequently, drugs that could simultaneously inhibit 5-LO and mast cell degranulation are increasingly being considered as promising therapeutic agents for asthma. The objective of this study was to evaluate the ability of PH-251 - an oxazolidinone hydroxamic acid derivative known for its ability to strongly inhibit the 5-LO enzyme – to simultaneously inhibit mast cell degranulation. The Bertin Bioreagent Histamine ELISA kit (Bertin Bioreagent, Montigny-le-Bretonneux, France) was used to evaluate the anti-degranulatory effect of PH-251 on in vivo lung anaphylaxis (a severe allergic reaction to a chemical). Briefly, the kit was used to measure the histamine content in the lung lavage fluid of mice, as an indicator of mast cell degranulation.
MATERIALS
In order to evaluate the anti-degranulatory effect of PH-251 on in vivo lung anaphylaxis, a group of mice was immunized and boosted as described below:
• Animals: BALB/c mice, originally obtained from Harlan Laboratories, Derby, UK, and bred in the facilities of Kuwait University were used. All animals were maintained under temperature-controlled conditions with an artificial 12-h light/dark cycle and allowed standard chow and water ad libitum.
• Immunization, challenge and drug treatment: Mice were immunized intraperitoneally as described in with 10 μg ovalbumin mixed with 0.2 ml of aluminum hydroxide gel (Alu-Gel-S; SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany), on days 0 and 7. Mice were separated into 5 treatment groups of 8 animals per group. Seven to ten days after the allergen booster dose, the different groups of animals were pretreated subcutaneously with the drug vehicle or PH-251 (30 mg/kg) or disodium cromoglycate (DSCG) (30 mg/kg) - an anti-asthma drug known to promote mast cell stabilization - or zileuton (30 mg/kg), 1 h before being challenged intra-tracheally with 50 µl of ovalbumin solution (0.25%) or PBS.
• Measurement of histamine content in mouse lung lavage fluid: Thirty minutes after the challenge, the animals were killed and the lungs immediately lavaged with 2 × 0.5 ml PBS. Lavage fluid was immediately centrifuged and the supernatant diluted 1: 10 in 0.1 N HClO4 and stored at − 70 ◦C till assay of histamine content as index of mast cell degranulation. Histamine assay was done using the Bertin Bioreagent Histamine ELISA kit (Bertin Bioreagent, cat # A05890, Montigny-le-Bretonneux, France, previously sold under the brand SPI-BIO). Values were expressed as histamine concentration (ng/ml) in the original lavage fluid and can be seen.
ITALIANO
L'istamina è una molecola che svolge un ruolo importante nelle risposte immunitarie locali, è coinvolta nella regolazione delle funzioni fisiologiche dell'intestino ed agisce come neurotrasmettitore per il cervello, il midollo spinale e l'utero. Come parte della risposta infiammatoria a un corpo estraneo, l'istamina viene prodotta e rilasciata dai basofili e dai mastociti. Un aumento dei livelli locali di istamina può portare i capillari a diventare più permeabili ai leucociti e ad alcune proteine, consentendo loro di attaccare i patogeni nei tessuti infetti. Dopo la sua scoperta nel 1910, l'istamina è stata identificata come un attore centrale nella fisiopatologia dell'allergia e dell'asma ed i farmaci che prendono di mira i suoi recettori sono stati utilizzati clinicamente dagli anni '40. Per comprendere il ruolo dell'istamina nelle reazioni infiammatorie, nonché gli effetti immunoregolatori dell'istamina in fisiologia e varie patologie, è essenziale essere in grado di misurare con precisione i livelli di istamina. Bertin Bioreagent ha progettato il kit Bertin Bioreagent Histamine ELISA per rilevare e quantificare l'istamina in matrici biologiche complesse. Il kit Bertin Bioreagent Histamine è stato ampiamente citato negli studi sull'infiammazione.
CONTESTO
L'istamina è un composto organico che svolge un ruolo importante nello sviluppo di molte malattie allergiche. I mastociti sono cellule multifunzionali che risiedono nei tessuti derivati dal midollo osseo che sono responsabili di una parte importante della produzione di istamina nel corpo. La maggior parte delle malattie allergiche sono innescate dall'interazione tra un allergene e gli anticorpi specifici dell'allergene presenti sulla membrana dei mastociti e dei basofili. Questa interazione porta alla degranulazione di queste cellule, che a sua volta provoca il rilascio di molti biomarcatori allergici ed infiammatori, inclusi i leucotrieni e l'istamina. I leucotrieni sono mediatori dell'infiammazione prodotti nei leucociti dall'acido arachidonico dall'enzima 5-lipossigenasi (5-LO). Ad esempio, nell'asma, sia il rilascio di cisteinilleucotrieni che il rilascio di istamina dai mastociti degranulatori sono responsabili del restringimento delle vie aeree che si verifica durante gli attacchi di asma. Tuttavia, attualmente, non esistono farmaci antiasmatici approvati in grado di inibire contemporaneamente la biosintesi dei leucotrieni - bloccando l'attività dell'enzima 5-LO - e la degranulazione dei mastociti. L'unico inibitore 5-LO approvato per il trattamento dell'asma, Zileuton, ha un'efficacia limitata che potrebbe essere collegata alla sua incapacità di influenzare la degranulazione dei mastociti. Di conseguenza, i farmaci che potrebbero inibire contemporaneamente il 5-LO e la degranulazione dei mastociti sono sempre più considerati agenti terapeutici promettenti per l'asma. L'obiettivo di questo studio era valutare la capacità del PH-251 - un derivato dell'acido ossazolidinone idrossamico noto per la sua capacità di inibire fortemente l'enzima 5-LO - di inibire simultaneamente la degranulazione dei mastociti. Il kit Bertin Bioreagent Histamine ELISA (Bertin Bioreagent, Montigny-le-Bretonneux, Francia) è stato utilizzato per valutare l'effetto anti-degranulatore del PH-251 sull'anafilassi polmonare in vivo (una grave reazione allergica a una sostanza chimica). In breve, il kit è stato utilizzato per misurare il contenuto di istamina nel liquido di lavaggio polmonare dei topi, come indicatore della degranulazione dei mastociti.
MATERIALI
Al fine di valutare l'effetto anti-degranulatore di PH-251 sull'anafilassi polmonare in vivo, un gruppo di topi è stato immunizzato e potenziato come descritto di seguito:
• Animali: sono stati utilizzati topi BALB/c, originariamente ottenuti da Harlan Laboratories, Derby, Regno Unito, e allevati nelle strutture dell'Università del Kuwait. Tutti gli animali sono stati mantenuti in condizioni di temperatura controllata con un ciclo luce/buio artificiale di 12 ore e sono stati ammessi cibo standard e acqua ad libitum.
• Immunizzazione, challenge e trattamento farmacologico: i topi sono stati immunizzati per via intraperitoneale come descritto in con 10 μg di ovoalbumina mescolata con 0,2 ml di gel di idrossido di alluminio (Alu-Gel-S; SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germania), nei giorni 0 e 7. Topi sono stati separati in 5 gruppi di trattamento di 8 animali per gruppo. Da sette a dieci giorni dopo la dose di richiamo dell'allergene, i diversi gruppi di animali sono stati pretrattati per via sottocutanea con il veicolo farmacologico o PH-251 (30 mg/kg) o cromoglicato disodico (DSCG) (30 mg/kg) - un farmaco antiasmatico noto per promuovere la stabilizzazione dei mastociti - o zileuton (30 mg/kg), 1 ora prima di essere sfidato per via intratracheale con 50 ml di soluzione di ovalbumina (0,25%) o PBS.
• Misurazione del contenuto di istamina nel liquido di lavaggio polmonare del topo: 30 minuti dopo il challenge, gli animali sono stati uccisi ed i polmoni sono stati immediatamente lavati con 2 × 0,5 ml di PBS. Il fluido di lavaggio è stato immediatamente centrifugato e il supernatante diluito 1: 10 in 0,1 N HClO4 e conservato a -70 ◦C fino al dosaggio del contenuto di istamina come indice di degranulazione dei mastociti. Il test dell'istamina è stato eseguito utilizzando il kit Bertin Bioreagent Histamine ELISA (Bertin Bioreagent, cat # A05890, Montigny-le-Bretonneux, Francia, precedentemente venduto con il marchio SPI-BIO). I valori sono stati espressi come concentrazione di istamina (ng/ml) nel fluido di lavaggio originale e possono essere visti.
Da:
file:///C:/Users/User/Downloads/BIOR_White-Paper_Histamine.pdf
Commenti
Posta un commento