Pyruvate kinase inhibitor measurements and effortless data analysis using the MARS data analysis software / Misurazioni dell'inibitore della piruvato chinasi ed analisi dei dati senza sforzo utilizzando il software di analisi dei dati MARS

Pyruvate kinase inhibitor measurements and effortless data analysis using the MARS data analysis software Misurazioni dell'inibitore della piruvato chinasi ed analisi dei dati senza sforzo utilizzando il software di analisi dei dati MARS


Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa


Fig. 1: Pyruvate kinase inhibitor assay principle and evaluation / Principio e valutazione dell'inibitore della piruvato chinasi

Introduction

Enzymes are proteins which can catalyse biochemical reactions. They are particularly important due to their role in the synthesis, modifi cation, and degradation of organic matter. Enzymatic reactions can range from the cleavage of intra-molecular bonds, transfer of electrons, ligation of molecules to the transfer of functional groups. Pyruvate kinase is an enzyme involved in energy-supplying glycolysis and ATP synthesis. It catalyses the transfer of a phosphate group from phosphoenolpyruvate to adenosine diphosphate (ADP), yielding pyruvate and ATP. Pyruvate kinase thus is pivotal for the eucaryotic energy metabolism. In addition, overexpression of pyruvate kinase is believed to play a role in cancer. Here, elevated levels of the PKM2 isoform of pyruvate kinase are used as a cancer marker and are associated with unfavourable prognosis. Accordingly, the development of pyruvate kinase inhibitors may offer new treatments for various cancers. This application note highlights the benefi ts of BMG LABTECH’s VANTAstarTM microplate reader and MARS data analysis software for the effortless application of a pyruvate kinase activity assay and its kinetic evaluation. This assay can be employed for the screening and identifi cation of pyruvate kinase inhibitors. 

Assay Principle

To test for pyruvate kinase inhibitors, kinetic measurements in the presence of increasing concentrations of pyruvate kinase inhibitor were performed. For this purpose, a pyruvate kinase activity assay kit and human recombinant pyruvate kinase were used. This assay is a coupled enzyme assay using two enzymatic reactions (fig. 1). First, pyruvate kinase transfers the phosphate group from phosphoenolpyruvate to ADP, yielding pyruvate and ATP. Pyruvate is then used in a second enzymatic reaction by the enzyme peroxidase. This results in a fl uorometric product, proportional to the pyruvate present. If a pyruvate kinase inhibitor is added, the amount of produced pyruvate and accordingly the amount of fl uorometric product is reduced, resulting in lower fluorescence signals 

Materials & Methods 

Black half area 96-well plate (#675076, Greiner) Human recombinant pyruvate kinase isoform M2 (#NATE-0938, Creative Enzymes) Pyruvate kinase activity assay kit (#MAK072, Sigma-Aldrich) Scutellarin (#DML0014-5MG, Sigma-Aldrich) VANTAstar microplate reader (BMG LABTECH) Experimental procedure Pyruvate kinase was employed at a concentration of 100 pU/mL, the enzyme activity kit was used according to the manufacturer’s instructions. 

1. Assay components were brought to room temperature.

 2. 44 µL of 1x assay buffer, 5 µL pyruvate kinase inhibitor solution/DMSO and 1 µL of 10 µU/mL pyruvate kinase were added to wells in a black half area 96-well plate. 

3. A reaction master mix, containing 44 µL 1x assay buffer, 2 µL pyruvate kinase substrate mix, 2 µL pyruvate kinase enzyme mix and 2 µL fluorescent peroxidase substrate per sample well, was freshly prepared. 

4. 50 µL of the reaction mix were added to each sample well to start the enzymatic reactions. 

5. Plates were immediately transferred to the VANTAstar and measured for 13 min. 

6. Kinetic data evaluation for pyruvate kinase inhibitors was performed with the MARS data analysis software.

Results & Discussion 

The pyruvate kinase inhibitor assay was established on the VANTAstar microplate reader. Measurements were performed employing different known pyruvate kinase inhibitors. Scutellarin, a flavone compound produced by different Lamiaceae of the Scutellaria genus, was chosen as an example to highlight the kinetic evaluation of pyruvate kinase inhibitors. Adding increasing concentrations of Scutellarin (0-25 µM) resulted in a dose-dependent reduction of pyruvate kinase activity, marking Scutellarin as an effective pyruvate kinase inhibitor. 

Due to the strong increase in fluorescence signal intensity over time, the Enhanced Dynamic Range (EDR) feature was essential in this process. Where conventional gain adjustment led to signal saturation within seconds, EDR allowed us to capture enzyme kinetic curves over the complete measurement range. EDR ensures flexible gain adjustment throughout kinetic measurements without the need of manual adjustment. BMG LABTECH’s MARS data analysis software was used to perform the kinetic evaluation of pyruvate kinase inhibitor measurements. Evaluation can be performed directly with the reader measurement files, requiring no further data export or data formatting. The software comes with a multitude of analysis options and available equations. In this case, a nonlinear 4-parameter fit of activity curve slopes over the pyruvate kinase inhibitor concentrations was selected to calculate the IC50 values for tested pyruvate kinase inhibitors. To achieve this, pyruvate kinase inhibitor concentrations were assigned to the respective measurement samples, and slopes of the activity curves were used as base for the 4-parameter standard curve calculation. This yielded kinetic parameters like slope, IC50 and R2. 

Conclusion 

The VANTAstar is an excellent platform for the performance of kinetic kinase assays such as the presented pyruvate kinase inhibitor assay. The EDR feature simplifies assay setup and optimisation circumventing unnecessary repetitions. By using the provided MARS data analysis software, the assay evaluation process can be substantially streamlined. By assigning the single calculation steps required for evaluation to a template, parameters like top, bottom, slope and IC50 can be determined by the click of a button.

ITALIANO

Introduzione

Gli enzimi sono proteine ​​che possono catalizzare reazioni biochimiche. Sono particolarmente importanti per il loro ruolo nella sintesi, modifica e degradazione della materia organica. Le reazioni enzimatiche possono variare dalla scissione di legami intramolecolari, al trasferimento di elettroni, alla legatura di molecole al trasferimento di gruppi funzionali. La piruvato chinasi è un enzima coinvolto nella glicolisi che fornisce energia e nella sintesi di ATP. Catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato dal fosfoenolpiruvato all'adenosina difosfato (ADP), producendo piruvato e ATP. La piruvato chinasi è quindi fondamentale per il metabolismo energetico eucariotico. Inoltre, si ritiene che la sovraespressione della piruvato chinasi svolga un ruolo nel cancro. Qui, livelli elevati dell'isoforma PKM2 della piruvato chinasi sono usati come marker del cancro e sono associati a prognosi sfavorevole. Di conseguenza, lo sviluppo di inibitori della piruvato chinasi può offrire nuovi trattamenti per vari tipi di cancro. Questa nota applicativa mette in evidenza i vantaggi del lettore di micropiastre VANTAstarTM di BMG LABTECH e del software di analisi dei dati MARS per l'applicazione senza sforzo di un test di attività della piruvato chinasi e la sua valutazione cinetica. Questo test può essere impiegato per lo screening e l'identificazione degli inibitori della piruvato chinasi.

Principio di analisi

Per testare gli inibitori della piruvato chinasi, sono state eseguite misurazioni cinetiche in presenza di concentrazioni crescenti di inibitore della piruvato chinasi. A tale scopo, sono stati utilizzati un kit di analisi dell'attività della piruvato chinasi ed una piruvato chinasi ricombinante umana. Questo test è un test enzimatico accoppiato che utilizza due reazioni enzimatiche (fig. 1). In primo luogo, la piruvato chinasi trasferisce il gruppo fosfato dal fosfoenolpiruvato all'ADP, producendo piruvato e ATP. Il piruvato viene quindi utilizzato in una seconda reazione enzimatica dall'enzima perossidasi. Ne risulta un prodotto fluometrico, proporzionale al piruvato presente. Se viene aggiunto un inibitore della piruvato chinasi, la quantità di piruvato prodotto e di conseguenza la quantità di prodotto fluorometrico si riduce, con conseguente riduzione dei segnali di fluorescenza

Materiali e metodi

Piastra a 96 pozzetti con semiarea nera (#675076, Greiner) Isoforma M2 della piruvato chinasi ricombinante umana (#NATE-0938, Enzimi creativi) Kit di analisi dell'attività della piruvato chinasi (#MAK072, Sigma-Aldrich) Scutellarin (#DML0014-5MG, Sigma- Aldrich) Lettore di micropiastre VANTAstar (BMG LABTECH) Procedura sperimentale La piruvato chinasi è stata impiegata a una concentrazione di 100 pU/mL, il kit di attività enzimatica è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore.

1. I componenti del test sono stati portati a temperatura ambiente.

 2. 44 µL di tampone di analisi 1x, 5 µL di soluzione di inibitore della piruvato chinasi/DMSO e 1 µL di 10 µU/mL di piruvato chinasi sono stati aggiunti ai pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con semiarea nera.

3. È stata preparata di fresco una master mix di reazione, contenente 44 µl di tampone di analisi 1x, 2 µl di mix di substrato di piruvato chinasi, 2 µl di mix di enzimi di piruvato chinasi e 2 µl di substrato di perossidasi fluorescente per pozzetto del campione.

4. 50 µL della miscela di reazione sono stati aggiunti a ciascun pozzetto del campione per avviare le reazioni enzimatiche.

5. Le piastre sono state immediatamente trasferite al VANTAstar e misurate per 13 min.

6. La valutazione dei dati cinetici per gli inibitori della piruvato chinasi è stata eseguita con il software di analisi dei dati MARS.

Risultati e discussione

Il test dell'inibitore della piruvato chinasi è stato stabilito sul lettore di micropiastre VANTAstar. Le misurazioni sono state eseguite impiegando diversi inibitori noti della piruvato chinasi. La scutellarina, un composto flavonico prodotto da diverse Lamiaceae del genere Scutellaria, è stata scelta come esempio per evidenziare la valutazione cinetica degli inibitori della piruvato chinasi. L'aggiunta di concentrazioni crescenti di Scutellarin (0-25 µM) ha comportato una riduzione dose-dipendente dell'attività della piruvato chinasi contrassegnando Scutellarin come un efficace inibitore della piruvato chinasi.

A causa del forte aumento dell'intensità del segnale di fluorescenza nel tempo, la funzione Enhanced Dynamic Range (EDR) era essenziale in questo processo. Laddove la regolazione del guadagno convenzionale ha portato alla saturazione del segnale in pochi secondi, l'EDR ci ha consentito di acquisire le curve cinetiche degli enzimi sull'intero intervallo di misurazione. L'EDR garantisce una regolazione flessibile del guadagno durante le misurazioni cinetiche senza la necessità di una regolazione manuale. Il software di analisi dei dati MARS di BMG LABTECH è stato utilizzato per eseguire la valutazione cinetica delle misurazioni dell'inibitore della piruvato chinasi. La valutazione può essere eseguita direttamente con i file di misurazione del lettore, senza che siano necessarie ulteriori esportazioni o formattazioni dei dati. Il software viene fornito con una moltitudine di opzioni di analisi ed equazioni disponibili. In questo caso, per calcolare i valori di IC50 per gli inibitori della piruvato chinasi testati è stato selezionato un adattamento non lineare a 4 parametri della pendenza della curva di attività sulle concentrazioni dell'inibitore della piruvato chinasi. Per ottenere ciò, le concentrazioni dell'inibitore della piruvato chinasi sono state assegnate ai rispettivi campioni di misurazione e le pendenze delle curve di attività sono state utilizzate come base per il calcolo della curva standard a 4 parametri. Ciò ha prodotto parametri cinetici come pendenza, IC50 e R2.

Conclusione

Il VANTAstar è un'eccellente piattaforma per l'esecuzione di saggi della chinasi cinetica come il saggio dell'inibitore della piruvato chinasi presentato. La funzione EDR semplifica l'impostazione e l'ottimizzazione del test aggirando le ripetizioni non necessarie. Utilizzando il software di analisi dei dati MARS in dotazione, il processo di valutazione del dosaggio può essere notevolmente semplificato. Assegnando i singoli passaggi di calcolo necessari per la valutazione ad un modello, parametri come cima, fondo, pendenza e IC50 possono essere determinati con un clic di un pulsante.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/BMG%20LabTech/October%202022/AN368.pdf?__hstc=8807082.f3ddaa81584799eacca500769af88bed.1664789177252.1667575071023.1667669174850.10&__hssc=8807082.1.1667669174850&__hsfp=1796390272&hsCtaTracking=3ab80af0-72ef-4554-9ff6-ff660616cb89%7C1e9b5019-7321-4c60-a39f-670d2295f66e

Commenti

Post popolari in questo blog

Paracetamolo, ibuprofene o novalgina: quali le differenze? / acetaminophen, ibuprofen, metamizole : what are the differences?

Uno studio fornisce una comprensione più chiara di come funziona il “farmaco miracoloso” Metformina / Study Gives Clearer Understanding of How “Wonder Drug” Metformin Works

Tracciare le origini metaboliche del cancro da un mosaico di cellule / Tracking Metabolic Origins of Cancer From a Mosaic of Cells