CRISPR YEAST . HOW CAS9 IS REPLACING THE NEED FOR PLANT DERIVED METABOLITES THROUGH YEAST ENGINEERING. / LIEVITO CRISPR. COME CAS9 SOSTITUISCE LA NECESSITÀ DI METABOLITI DERIVATI DA VEGETALI ATTRAVERSO L'INGEGNERIA DEL LIEVITO

CRISPR YEAST . HOW CAS9 IS REPLACING THE NEED FOR PLANT DERIVED METABOLITES THROUGH YEAST ENGINEERING. / LIEVITO CRISPR. COME CAS9 SOSTITUISCE LA NECESSITÀ DI METABOLITI DERIVATI DA VEGETALI ATTRAVERSO L'INGEGNERIA DEL LIEVITO

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

OVERVIEW 

Yeast has limited endogenous specialized metabolism pathways, which minimizes competition with introduced pathways. (Pyne et al., 2019). Yeast partially shares primary metabolism pathways with plants, which means plant-specialized metabolism pathways can be easily plugged into the existing pool of yeast primary metabolite precursors, albeit some flux enhancement may be required. It is relatively safe to work with non-pathogenic yeast, recognized as one of the generally safe microbes. Finally, yeast can carry out certain post-translational modifications, something generally lacking in most bacterial strains. (Siddiqui et al., 2012)

A vast amount of important molecules of interest originate from plant specialized metabolites, most of which are synthesized via complex biosynthetic pathways. These compounds play an essential role in plant defence mechanisms and have uses across pharmaceutical, cosmetics, food, fashion and agricultural industries. Despite the vast chemical diversity of natural compounds, their content in plants is often very low, and, as a consequence, this lowers the possibility of high-yielding production of these secondary metabolites from plants. Therefore, microorganisms are widely used as cell factories by industrial biotechnology in the production of different non-native compounds. Among microorganisms commonly used in such applications, yeast is a prominent host for the diverse secondary metabolite biosynthetic pathways. 

Why employ yeast as a biosynthesis system? 

Efficient yeast transformation techniques simplify the day-to-day use of yeast. 

Yeast has efficient homologous recombination machinery allowing targeted stable incorporation of DNA into its chromosomes.

Yeast has limited endogenous specialized metabolism pathways, which minimizes competition with introduced pathways. (Pyne et al., 2019).

Yeast partially shares primary metabolism pathways with plants, which means plant-specialized metabolism pathways can be easily plugged into the existing pool of yeast primary metabolite precursors, albeit some flux enhancement may be required

It is relatively safe to work with non-pathogenic yeast, recognized as one of the generally safe microbes.

 Finally, yeast can carry out certain post-translational modifications, something generally lacking in most bacterial strains. (Siddiqui et al., 2012)

Why CRISPR/Cas9? 

Despite all the advantages of yeast biosynthesis, reconstructing complex pathways in yeast can still be challenging using traditional methods. Use of plasmids is plagued by plasmid instability and imbalance. It is often difficult to achieve consistent levels of recombinant expression in individual cells, which can lead to different degrees of toxicity and metabolic burden in each yeast cell (Da Silva and Srikrishnan, 2012). Thus, the integration of heterologous genes into the yeast genome is preferred for stable expression. But using homologous recombination, scientists are constrained by a limited number of selection markers for stable transformation. 

Gene integration techniques in yeast, such as in vivo homologous recombination and pre-CRISPR nuclease-based systems (e.g., I-SceI, HO endonuclease, ZFNs, and TALENs), have been extensively developed. (David and Siewers, 2015). However, these integration techniques are laborious and are limited by the availability of efficient integration sites, the need for selection markers, or the complexity of design and delivery to target multiple sites.

CRISPR/Cas9 is an elegant and simple technique that has been demonstrated to be effective in a variety organisms. The simplicity, efficiency, and flexibility of CRISPR/Cas9 has greatly stimulated metabolic engineering in yeast. A practical use of CRISPR/Cas9 in yeast is multiplex genome editing aimed at reconstructing complex metabolic pathways (Mali et al., 2013). This system has the capability of efficiently integrating multiple genes of interest in a single transformation without the express need for selection markers, simplifying the reconstruction of complex pathways. As plant specialized metabolites usually have complex multigene biosynthetic pathways, the multiplex CRISPR/Cas9 system in yeast is suited well for functional genomics research in plant specialized metabolism.

Pharmaceuticals:

Flavonoids play an important role in healthcare with their antioxidant, antibacterial, and anti-inflammatory activities (Adamczak et al, 2020). However, yeast does not naturally produce phenylpropanoid phenolics, where its metabolism provides the necessary aromatic amino acids precursors for the further phenolic biosynthesis pathway. Coumaric acid is a phenolic acid of the hydroxycinnamic acid family, and it has many biological functions such as anti-oxidant, anti-inflammatory, antidiabetic, anti-ulcer, anti-platelet, anti-cancer activities. (Ilavenil et al, 2016) Koopman et al reported that S. cerevisiae is capable of de novo production of naringenin by co-expressing the naringenin production genes from A. thaliana and optimization of the flux towards the naringenin pathway. In doing so, they demonstrated that engineered yeast naringenin production host provides a metabolic chassis for production of a wide range of pharmaceutically important flavonoids.

Dyes: Cosmetics, Fashion, Food 

Anthocyanins are one of the most important plant pigments, and they are responsible for most of the red, blue, and purple colours of leaves, fruits, and flowers with applications in the cosmetic, food and fashion industries. Anthocyanins are considered as flavonoids due to their C6-C3-C6 chemical structure, although they have a positive charge at the oxygen atom of the C-ring of the basic flavonoid structure. (Kong et al,. 2003). Anthocyanins are produced in a specific branch of the flavonoid pathway. From naringenin, they are biosynthesized by flavanone 3-hydroxylase, dihydroflavonol 4-reductase, and anthocyanidin synthase. This requires the insertion of a minimum of 3 three genes.

Eichenberger et al. successfully reconstituted the full pathway of the biosynthesis of pelargonidin-3-O-glucoside (P3G), cyanidin-3-Oglucoside, and delphinidin-3-O-glucoside within S. cerevisiae using flanked 60 base pair homologous recombination. (Eichenberger et al,. 2018)

Brewing:

 In brewing, additions of Humulus lupulus plant (Hops) are made as a source of bitterness, aroma, and flavour in beer. Hops contain volatile thiols that impart a variety of desirable flavours and aromas in beer. Two volatile thiols of particular interest are 3-mercaptohexan-1-ol and its acetate ester, 3-mercaptohexyl acetate, which impart guava and passionfruit flavours, respectively. Yeasts also produce a variety of volatile organic compounds during their primary and secondary metabolism which also contribute to the flavour and aroma profile of the final product like beer, wine and spirits. These metabolic routes allow for the insertion of new genes responsible for flavour compounds that can then be synthesised by the yeast. (Molitor et al., 2022). Molitor et al. achieved the integration of a gene encoding a highly active cysteine S-conjugate beta-lyase enzyme that converts thiol precursors into the volatile thiol, 3MH. The newly engineered yeast strain produced beer that had up to 73- fold higher 3MH. The beers were described as “intensely tropical and fruity”, achieved without Hops but instead with genetically engineered yeast. (Molitor et al., 2022

Other Uses: Other than gene integration, multiplex CRISPR/Cas9 can also be used to optimize yeast strains via metabolic engineering strategies, such as gene disruption for eliminating competing pathways, gene downregulation for diminishing competing but important pathways, and gene upregulation for boosting endogenous yeast pathways ( Sander and Joung, 2014; Pyne et al., 2019).

CONCLUDING REMARKS 

CRISPR/Cas9 allows for simplicity in multiplex genome editing in yeast with the aim of reconstructing complex metabolic pathways quickly and efficiently. This system has the capability of integrating multiple genes of interest in a single transformation, simplifying the reconstruction of these complex pathways. As plant specialized metabolites usually have complex multigene biosynthetic pathways, the multiplex CRISPR/Cas9 system in yeast is excellent in functional genomics plant specialized metabolism for molecules of interest to the pharmaceutical, cosmetic, fashion, brewing and food industries.

ITALIANO

PANORAMICA

Il lievito ha percorsi metabolici specializzati endogeni limitati, il che riduce al minimo la concorrenza con i percorsi introdotti. (Pine et al., 2019). Il lievito condivide parzialmente le vie del metabolismo primario con le piante, il che significa che le vie del metabolismo specializzate nelle piante possono essere facilmente inserite nel pool esistente di precursori del metabolita primario del lievito, sebbene possa essere necessario un miglioramento del flusso. È relativamente sicuro lavorare con lievito non patogeno, riconosciuto come uno dei microbi generalmente sicuri. Infine, il lievito può effettuare alcune modifiche post-traduzionali, qualcosa che generalmente manca nella maggior parte dei ceppi batterici. (Siddiquì et al., 2012)

Una grande quantità di importanti molecole di interesse proviene da metaboliti specializzati nelle piante, la maggior parte dei quali è sintetizzata attraverso complessi percorsi biosintetici. Questi composti svolgono un ruolo essenziale nei meccanismi di difesa delle piante e trovano impiego nell'industria farmaceutica, cosmetica, alimentare, della moda e agricola. Nonostante la vasta diversità chimica dei composti naturali, il loro contenuto nelle piante è spesso molto basso e, di conseguenza, ciò riduce la possibilità di una produzione ad alto rendimento di questi metaboliti secondari dalle piante. Pertanto, i microrganismi sono ampiamente utilizzati come fabbriche di cellule dalla biotecnologia industriale nella produzione di diversi composti non nativi. Tra i microrganismi comunemente usati in tali applicazioni, il lievito è un ospite importante per le diverse vie biosintetiche del metabolita secondario.

Perché impiegare il lievito come sistema di biosintesi?

Efficienti tecniche di trasformazione del lievito semplificano l'uso quotidiano del lievito.

Il lievito ha un efficiente meccanismo di ricombinazione omologa che consente l'incorporazione stabile e mirata del DNA nei suoi cromosomi.

Il lievito ha percorsi metabolici specializzati endogeni limitati, il che riduce al minimo la concorrenza con i percorsi introdotti. (Pine et al., 2019).

Il lievito condivide parzialmente le vie metaboliche primarie con le piante, il che significa che le vie metaboliche specializzate nelle piante possono essere facilmente inserite nel pool esistente di precursori del metabolita primario del lievito, sebbene possa essere necessario un miglioramento del flusso

È relativamente sicuro lavorare con lievito non patogeno, riconosciuto come uno dei microbi generalmente sicuri.

  Infine, il lievito può effettuare alcune modifiche post-traduzionali, qualcosa che generalmente manca nella maggior parte dei ceppi batterici. (Siddiquì et al., 2012)

Perché CRISPR/Cas9?

Nonostante tutti i vantaggi della biosintesi del lievito, la ricostruzione di percorsi complessi nel lievito può essere ancora impegnativa con i metodi tradizionali. L'uso di plasmidi è afflitto da instabilità e squilibrio del plasmide. Spesso è difficile raggiungere livelli coerenti di espressione ricombinante nelle singole cellule, il che può portare a diversi gradi di tossicità e carico metabolico in ciascuna cellula di lievito (Da Silva e Srikrishnan, 2012). Pertanto, l'integrazione di geni eterologhi nel genoma del lievito è preferita per un'espressione stabile. Ma usando la ricombinazione omologa, gli scienziati sono vincolati da un numero limitato di marcatori di selezione per una trasformazione stabile.

Le tecniche di integrazione genica nel lievito, come la ricombinazione omologa in vivo e i sistemi basati su nucleasi pre-CRISPR (ad es. I-SceI, HO endonucleasi, ZFN e TALEN), sono state ampiamente sviluppate. (David e Siewers, 2015). Tuttavia, queste tecniche di integrazione sono laboriose e sono limitate dalla disponibilità di siti di integrazione efficienti, dalla necessità di marcatori di selezione o dalla complessità della progettazione e della consegna per indirizzare più siti.

CRISPR/Cas9 è una tecnica elegante e semplice che si è dimostrata efficace in una varietà di organismi. La semplicità, l'efficienza e la flessibilità di CRISPR/Cas9 ha fortemente stimolato l'ingegneria metabolica nel lievito. Un uso pratico di CRISPR/Cas9 nel lievito è l'editing del genoma multiplex volto a ricostruire complesse vie metaboliche (Mali et al., 2013). Questo sistema ha la capacità di integrare in modo efficiente più geni di interesse in una singola trasformazione senza l'espressa necessità di marcatori di selezione, semplificando la ricostruzione di percorsi complessi. Poiché i metaboliti specializzati nelle piante di solito hanno complesse vie biosintetiche multigeniche, il sistema multiplex CRISPR/Cas9 nel lievito è adatto per la ricerca di genomica funzionale nel metabolismo specializzato nelle piante.

Prodotti farmaceutici:

I flavonoidi svolgono un ruolo importante nell'assistenza sanitaria con le loro attività antiossidanti, antibatteriche e antinfiammatorie (Adamczak et al, 2020). Tuttavia, il lievito non produce naturalmente fenoli fenilpropanoidi, dove il suo metabolismo fornisce i necessari precursori di aminoacidi aromatici per l'ulteriore via di biosintesi fenolica. L'acido cumarico è un acido fenolico della famiglia dell'acido idrossicinnamico e ha molte funzioni biologiche come attività antiossidante, antinfiammatoria, antidiabetica, antiulcera, antipiastrinica, antitumorale. (Ilavenil et al, 2016) Koopman et al hanno riferito che S. cerevisiae è in grado di produrre de novo di naringenina coesprimendo i geni di produzione di naringenina da A. thaliana e ottimizzando il flusso verso la via della naringenina. In tal modo, hanno dimostrato che l'ospite di produzione di naringenina di lievito ingegnerizzato fornisce un telaio metabolico per la produzione di un'ampia gamma di flavonoidi importanti dal punto di vista farmaceutico.

Coloranti: Cosmesi, Moda, Cibo

Gli antociani sono uno dei pigmenti vegetali più importanti e sono responsabili della maggior parte dei colori rosso, blu e viola di foglie, frutti e fiori con applicazioni nell'industria cosmetica, alimentare e della moda. Gli antociani sono considerati flavonoidi a causa della loro struttura chimica C6-C3-C6, sebbene abbiano una carica positiva all'atomo di ossigeno dell'anello C della struttura flavonoidica di base. (Kong et al., 2003). Gli antociani sono prodotti in un ramo specifico della via dei flavonoidi. Dalla naringenina, sono biosintetizzati dalla flavanone 3-idrossilasi, dalla diidroflavonolo 4-reduttasi e dall'antocianidina sintasi. Ciò richiede l'inserimento di un minimo di 3 tre geni.

Eichenberger et al. ha ricostituito con successo l'intero percorso della biosintesi di pelargonidina-3-O-glucoside (P3G), cianidina-3-oglucoside e delfinidina-3-O-glucoside all'interno di S. cerevisiae utilizzando la ricombinazione omologa affiancata di 60 paia di basi. (Eichenberger et al., 2018)

Birra:

 Nella produzione della birra, le aggiunte della pianta Humulus lupulus (luppolo) vengono apportate come fonte di amarezza, aroma e sapore nella birra. Il luppolo contiene tioli volatili che conferiscono alla birra una varietà di sapori ed aromi desiderabili. Due tioli volatili di particolare interesse sono il 3-mercaptoesan-1-olo e il suo estere acetato, il 3-mercaptoesil acetato, che conferiscono rispettivamente sapori di guava e frutto della passione. I lieviti producono anche una varietà di composti organici volatili durante il loro metabolismo primario e secondario che contribuiscono anche al profilo aromatico e aromatico del prodotto finale come birra, vino e alcolici. Queste vie metaboliche consentono l'inserimento di nuovi geni responsabili di composti aromatici che possono poi essere sintetizzati dal lievito. (Molitor et al., 2022). Moltor et al. raggiunto l'integrazione di un gene che codifica per un enzima beta-liasi cisteina S-coniugato altamente attivo che converte i precursori del tiolo nel tiolo volatile, 3MH. Il ceppo di lievito di nuova concezione ha prodotto una birra con 3MH fino a 73 volte superiore. Le birre sono state descritte come "intensamente tropicali e fruttate", ottenute senza luppolo ma con lievito geneticamente modificato. (Molitor et al., 2022

Altri usi: oltre all'integrazione genica, il multiplex CRISPR/Cas9 può anche essere utilizzato per ottimizzare i ceppi di lievito tramite strategie di ingegneria metabolica, come l'interruzione genica per eliminare i percorsi concorrenti, la downregulation genica per diminuire i percorsi concorrenti ma importanti e la sovraregolazione genica per potenziare il lievito endogeno percorsi ( Sander e Joung, 2014; Pyne et al., 2019).

OSSERVAZIONI CONCLUSIVE

CRISPR/Cas9 consente semplicità nell'editing del genoma multiplex nel lievito con l'obiettivo di ricostruire percorsi metabolici complessi in modo rapido ed efficiente. Questo sistema ha la capacità di integrare più geni di interesse in una singola trasformazione, semplificando la ricostruzione di questi percorsi complessi. Poiché i metaboliti specializzati in piante di solito hanno complesse vie biosintetiche multigeniche, il sistema multiplex CRISPR/Cas9 nel lievito è eccellente nel metabolismo specializzato in piante di genomica funzionale per molecole di interesse per l'industria farmaceutica, cosmetica, della moda, della birra e alimentare.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/ERS%20Genomics/2023/CRISPR%20Yeast.pdf?__hstc=8807082.12984a077ec53ed25be6891ba5d486ff.1677583849998.1688561928064.1688567071427.366&__hssc=8807082.7.1688567071427&__hsfp=1129121729&hsCtaTracking=efa2f44a-5405-4e19-95a2-6e15f6986894%7C9f13438a-3742-4eb5-aee2-07051a6bda0e