Il sequenziamento a lettura lunga mostra il collegamento tra lo splicing della microglia e la neurodegenerazione / Long-Read Sequencing Shows Microglia Splicing’s Link to Neurodegeneration

 Il sequenziamento a lettura lunga mostra il collegamento tra lo splicing della microglia e la neurodegenerazione / Long-Read Sequencing Shows Microglia Splicing’s Link to Neurodegeneration

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Un nuovo studio di Nature Genetics riporta un'immersione profonda nelle complessità genetiche della microglia, i guardiani immunitari del cervello, che detengono la chiave per svelare i misteri delle malattie neurodegenerative come l'Alzheimer ed il Parkinson. I ricercatori della Icahn School of Medicine al Mount Sinai hanno generato una nuova risorsa rivoluzionaria per comprendere come la microglia si unisce ed esprime i propri geni, chiamata atlante genomico della microglia incentrato sulle isoforme (isoMiGA). Identificando oltre 35.000 nuove isoforme specifiche della microglia ed analizzandone i ruoli in diverse regioni del cervello, i ricercatori hanno scoperto nuove connessioni tra loci di rischio genetico e malattie neurodegenerative, offrendo nuove intuizioni su come la regolazione genica della microglia possa guidare la neurodegenerazione.

Decodifica della microglia

La microglia, le cellule immunitarie innate del sistema nervoso centrale, sono emerse come attori critici nelle malattie neurodegenerative come l'Alzheimer e il Parkinson, come dimostrato dagli studi genetici dell'ultimo decennio. La ricerca che integra studi di associazione genomica (GWAS), dati di espressione genica ed annotazioni epigenetiche ha rivelato che le varianti genetiche influenzano l'espressione genica specifica della microglia attraverso potenziatori e meccanismi di splicing. I loci di tratti quantitativi di splicing (sQTL), che collegano le varianti genetiche alle variazioni di isoforme di mRNA, forniscono approfondimenti più approfonditi sulla base genetica della malattia.

Tuttavia, gli strumenti di mappatura sQTL esistenti come Leafcutter, lo strumento di mappatura sQTL più ampiamente utilizzato, presentano delle limitazioni nel rilevamento di isoforme specifiche e trascrizioni rare. I recenti progressi nel sequenziamento di RNA a lettura lunga consentono l'identificazione di nuove isoforme di mRNA e frame di lettura aperti, colmando queste lacune. Combinando questo approccio con il tradizionale sequenziamento di RNA a lettura corta, i ricercatori hanno ampliato la loro comprensione della regolazione genetica della microglia, scoprendo nuove intuizioni sui meccanismi della malattia.

35.879 nuove isoforme di RNA

Utilizzando la piattaforma Pacific Biosciences IsoSeq, il gruppo di ricerca guidato dai co-autori senior Panos Roussos, MD, PhD, e Towfique Raj, PhD, ha sequenziato l'RNA da 30 campioni cerebrali post-mortem, prevalentemente dalla corteccia prefrontale e dal giro frontale mediale. Il set di dati includeva campioni di individui con malattie neurodegenerative e controlli sani. I ricercatori hanno generato oltre 89 milioni di letture di RNA di alta qualità, la maggior parte delle quali si allineava in modo univoco al genoma umano. Combinando il sequenziamento a lettura lunga con il tradizionale sequenziamento di RNA a lettura corta, sono state identificate 128.436 isoforme che abbracciano 25.956 geni. Sorprendentemente, più di 35.879 di queste isoforme erano nuove, fornendo nuove intuizioni sugli eventi di splicing dell'RNA e sul loro significato biologico.

Lo studio ha evidenziato l'uso di promotori alternativi come l'evento di splicing più comune, mentre la ritenzione di introni, un fenomeno in cui vengono mantenute regioni non codificanti dei geni, era più abbondante rispetto ai riferimenti genomici esistenti. Tra le nuove scoperte c'erano 32.459 isoforme che corrispondevano parzialmente a sequenze note, inclusi i trascritti con disposizioni uniche del sito di splicing. Inoltre, i ricercatori hanno identificato quasi 1.800 isoforme di fusione, in cui due geni adiacenti vengono uniti insieme, suggerendo interazioni geniche precedentemente sconosciute.

È stato anche valutato il potenziale di codifica proteica. Alcune nuove isoforme, come quelle con corrispondenze di splicing parziali, hanno mostrato un elevato potenziale di codifica proteica. Ciò è stato confermato utilizzando la spettrometria di massa, dove 69 peptidi corrispondevano in modo univoco a 112 nuove isoforme, suggerendo la produzione di proteine ​​precedentemente sconosciute. Tra queste scoperte c'era una nuova isoforma del gene HNRNPK, un regolatore associato all'invecchiamento ed alla funzione cerebrale.

Implicazioni per le malattie neurodegenerative

L'attenzione dello studio sui geni con legami noti con la malattia di Alzheimer, tra cui TREM2 e CD33, ha rivelato una sorprendente diversità nelle loro isoforme. Ad esempio, si è scoperto che TREM2 produce isoforme di fusione readthrough che si combinano con sequenze di geni vicini, come TREML1. Si prevedeva che alcune isoforme di fusione codificassero proteine ​​funzionali, che potrebbero influenzare le risposte immunitarie del cervello in condizioni di salute e malattia.

Ulteriori esperimenti hanno mostrato che nuove isoforme rispondevano a stimoli infiammatori, come il lipopolisaccaride e l'interferone-gamma, rivelando potenziali ruoli nell'attivazione della microglia. Inoltre, le differenze regionali nell'espressione genica della microglia hanno evidenziato nuove isoforme, come quelle collegate al gene PICALM, con possibili implicazioni per la suscettibilità alle malattie neurodegenerative.

Attraverso una meta-analisi multi-ascendenza della regolazione genetica microgliale, lo studio ha mappato i QTL di espressione (eQTL) e gli sQTL, scoprendo differenze negli effetti genetici tra i loci dell'Alzheimer e del Parkinson. È interessante notare che i loci del Parkinson sono prevalentemente collegati ai QTL di espressione (eQTL) o agli effetti condivisi eQTL-sQTL, mentre i loci del Parkinson spesso coinvolgono esclusivamente gli sQTL. Mentre gli sQTL mostrano attività tra tipi di cellule a causa del loro impatto sui siti di splicing, il loro ruolo nel Parkinson suggerisce possibili effetti sui tipi di cellule non microgliali.

Questo studio sottolinea il potere del sequenziamento dell'RNA a lettura lunga per scoprire la complessità nascosta del trascrittoma umano. Identificando migliaia di isoforme precedentemente sconosciute e le loro potenziali funzioni, i ricercatori hanno aperto nuove strade per comprendere le basi molecolari delle malattie cerebrali. Queste scoperte non solo arricchiscono la nostra conoscenza della biologia della microglia, ma aprono anche la strada a strategie terapeutiche mirate nella neurodegenerazione.  

ENGLISH

A new Nature Genetics study reports on a deep dive into the genetic intricacies of microglia—the brain’s immune guardians, which hold the key to unraveling the mysteries of neurodegenerative diseases like Alzheimer’s and Parkinson’s. Researchers from the Icahn School of Medicine at Mount Sinai have generated a breakthrough new resource for understanding how microglia splice and express their genes called isoform-centric microglia genomic atlas (isoMiGA). By identifying over 35,000 novel microglia-specific isoforms and analyzing their roles across diverse brain regions, the researchers have uncovered new connections between genetic risk loci and neurodegenerative diseases, offering fresh insights into how microglial gene regulation may drive neurodegeneration.

Decoding microglia

Microglia, the innate immune cells of the central nervous system, have emerged as critical players in neurodegenerative diseases like Alzheimer’s and Parkinson’s, as evidenced by genetic studies over the past decade. Research integrating genome-wide association studies (GWAS), gene expression data, and epigenetic annotations has revealed that genetic variants influence microglia-specific gene expression through enhancers and splicing mechanisms. Splicing quantitative trait loci (sQTLs), which link genetic variants to mRNA isoform variations, provide deeper insights into the genetic basis of disease.

However, existing sQTL mapping tools like Leafcutter, the most widely used sQTL mapping tool, face limitations in detecting specific isoforms and rare transcripts. Recent advancements in long-read RNA sequencing enable the identification of novel mRNA isoforms and open reading frames, addressing these gaps. By combining this approach with traditional short-read RNA sequencing, researchers have expanded their understanding of microglial genetic regulation, uncovering new insights into disease mechanisms.

35,879 new RNA isoforms

Using the Pacific Biosciences IsoSeq platform, the research team led by co-senior authors Panos Roussos, MD, PhD, and Towfique Raj, PhD, sequenced RNA from 30 postmortem brain samples, predominantly from the prefrontal cortex and medial frontal gyrus. The dataset included samples from individuals with neurodegenerative diseases and healthy controls. The researchers generated over 89 million high-quality RNA reads, most aligning uniquely to the human genome. Combining long-read sequencing with traditional short-read RNA sequencing identified 128,436 isoforms spanning 25,956 genes. Remarkably, more than 35,879 of these isoforms were novel, providing new insights into RNA splicing events and their biological significance.

The study highlighted alternative promoter usage as the most common splicing event, while intron retention—a phenomenon where noncoding regions of genes are retained—was more abundant compared to existing genomic references. Among the novel discoveries were 32,459 isoforms that partially matched known sequences, including transcripts with unique splice site arrangements. In addition, the researchers identified nearly 1,800 fusion isoforms, where two adjacent genes are spliced together, suggesting previously unknown gene interactions.

Protein-coding potential was also assessed. Some novel isoforms, such as those with partial splice matches, exhibited high protein-coding potential. This was confirmed using mass spectrometry, where 69 peptides matched uniquely to 112 novel isoforms, hinting at the production of previously unknown proteins. Among these findings was a new isoform of the HNRNPK gene, a regulator associated with aging and brain function.

Implications for neurodegenerative diseases

The study’s focus on genes with known links to Alzheimer’s disease, including TREM2 and CD33, revealed surprising diversity in their isoforms. For example, TREM2 was found to produce readthrough fusion isoforms that combined with sequences from neighboring genes, such as TREML1. Some fusion isoforms were predicted to encode functional proteins, which may influence brain immune responses in health and disease.

Further experiments showed that novel isoforms responded to inflammatory stimuli, such as lipopolysaccharide and interferon-gamma, revealing potential roles in microglial activation. Additionally, regional differences in microglial gene expression highlighted novel isoforms, such as those linked to the PICALM gene, with possible implications for neurodegenerative disease susceptibility.

Through a multi-ancestry meta-analysis of microglial genetic regulation, the study mapped expression QTLs (eQTLs) and sQTLs, uncovering differences in genetic effects between Alzheimer’s and Parkinson’s disease loci. Interestingly, Alzheimer’s disease loci are predominantly linked to expression QTLs (eQTLs) or shared eQTL-sQTL effects, while Parkinson’s disease loci often involve sQTLs exclusively. While sQTLs show cross-cell-type activity due to their impact on splice sites, their role in Parkinson’s disease suggests possible effects on non-microglial cell types.

This study underscores the power of long-read RNA sequencing to uncover the hidden complexity of the human transcriptome. By identifying thousands of previously unknown isoforms and their potential functions, researchers have opened new avenues for understanding the molecular underpinnings of brain diseases. These findings not only enrich our knowledge of microglial biology but also pave the way for targeted therapeutic strategies in neurodegeneration.

Da:

https://www.insideprecisionmedicine.com/topics/informatics/long-read-sequencing-shows-microglia-splicings-link-to-neurodegeneration/