Ingegneria proteica per terapie cellulari CAR-T di nuova generazione / Protein Engineering for Next-Generation CAR T Cell Therapies
Ingegneria proteica per terapie cellulari CAR-T di nuova generazione / Protein Engineering for Next-Generation CAR T Cell Therapies
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
La terapia con cellule CAR T ha rivoluzionato il trattamento del cancro, ma il suo successo clinico è frenato da difficoltà in termini di sicurezza, specificità e controllo.
Intervenendo al recente convegno "Landscape of Cancer Research: Advances in Immuno-oncology 2025" di Technology Networks, il dott. Michael Traxlmayr dell'Università BOKU, in Austria, ha spiegato in dettaglio come l'ingegneria proteica avanzata possa creare "nuovi mattoncini Lego" per le cellule CAR T, strumenti molecolari personalizzati che migliorano il targeting del tumore, riducono la tossicità e consentono il controllo delle piccole molecole.
"Immaginate di giocare ai Lego e di poter creare i vostri mattoncini con nuove proprietà. È quello che facciamo per le cellule CAR-T", ha riassunto Traxlmayr.
Dal progetto modulare ai componenti personalizzati
I recettori antigenici chimerici (CAR) sono proteine sintetiche assemblate a partire da domini di obiettivi derivati da anticorpi, regioni transmembrana e sequenze di segnalazione intracellulare. Traxlmayr ha descritto l'evoluzione di questo campo di ricerca dai CAR di prima generazione – efficaci nell'uccidere le cellule bersaglio ma privi di persistenza – ai progetti di seconda generazione che incorporano domini co-stimolatori per la proliferazione e la durata.
L'ingegneria proteica consente ora ai ricercatori di andare oltre la semplice riorganizzazione dei "blocchi" esistenti, creandone di completamente nuovi. Questi possono essere personalizzati per affrontare i limiti di efficacia, specificità e sicurezza.
Accensione e spegnimento delle cellule CAR T
Una delle principali innovazioni del gruppo di Traxlmayr è lo sviluppo di "interruttori" CAR T regolati da piccole molecole. Dividendo un CAR in due catene proteiche separate, una con il dominio legante l'antigene, l'altra con il dominio di segnalazione, il linfocita T rimane inattivo finché una piccola molecola non ne induce l'assemblaggio.
"Non è come un farmaco a piccole molecole che si può interrompere. Le cellule CAR-T possono persistere per anni. Avere un meccanismo di controllo funzionale in vivo rappresenterebbe un notevole miglioramento", ha affermato.
Il sistema di commutazione basato sulla proteina legante il retinolo 4, sviluppato in laboratorio, utilizza una proteina lipocalina umana che cambia conformazione quando si lega a uno specifico farmaco disponibile per via orale (1120). Un legante ingegnerizzato riconosce solo la forma legata al farmaco, consentendo un'attivazione precisa del CAR.
Auto sensibili alla caffeina
Il gruppo di Traxlmayr ha anche sviluppato un interruttore CAR sensibile alla caffeina. Derivato da un nanocorpo di camelide che dimerizza in presenza di caffeina, il sistema è stato riprogettato per formare eterodimeri solo in presenza di caffeina, eliminando l'attivazione di fondo.
In vitro, questi CAR sono rimasti inattivi ai livelli di caffeina tipici delle persone che evitano il composto, ma si sono attivati a concentrazioni raggiungibili dopo una singola tazza di caffè. Nei modelli di linfoma murino, la somministrazione di caffeina ha innescato in modo efficace il controllo del tumore.
"Possiamo regolare l'attività delle cellule CAR T in vivo nei topi semplicemente tramite la somministrazione di caffeina", ha affermato Traxlmayr.
Stabilizzazione di un antigene critico: CD19
Il CD19 è l'antigene più ampiamente bersaglio nella terapia CAR-T per le neoplasie a cellule B, ma il suo dominio extracellulare è instabile e difficile da produrre. Il laboratorio di Traxlmayr ha utilizzato l'evoluzione guidata per identificare varianti di CD19 "superfolder" con sole mutazioni a tre punti che migliorano notevolmente la stabilità mantenendo l'affinità di legame wild-type.
Queste varianti consentono:
- Misurazioni precise dell'affinità per i costrutti CAR.
- Monitoraggio del paziente, mediante l'uso di CD19 marcato per rilevare le cellule CAR T nei campioni di sangue.
- Studi strutturali, come dimostrato dai collaboratori che hanno risolto la struttura crio-EM di un scFv di un CAR clinico legato a CD19.
Piattaforma MiniCAR: domini di legame più piccoli ed intelligenti
La maggior parte dei CAR utilizza frammenti variabili a catena singola (scFv) derivati da anticorpi, ma questi possono disappaiarsi, aggregarsi e causare segnalazione tonica o immunogenicità. Il gruppo di Traxlmayr ha progettato la piattaforma MiniCAR: piccoli moduli di legame umano a singolo dominio selezionati per stabilità, espressione e bassa segnalazione di fondo.
Lo screening ha prodotto leganti per molteplici antigeni, tra cui CD22, con affinità picomolare. Modelli in vitro e murini hanno mostrato che i costrutti basati su MiniCAR erano equivalenti o superiori alla potenza dei CAR basati su scFv.
Obiettivi delle conformazioni recettoriali specifiche del tumore
Nei tumori solidi, molti antigeni "associati al tumore" sono presenti anche nei tessuti sani, con conseguenti effetti indesiderati. Per risolvere questo problema, il laboratorio ha progettato un legante che riconosce solo la conformazione attiva, legata al ligando, dell'EGFR, comune negli ambienti tumorali a causa dell'elevata secrezione del ligando.
Le cellule CAR T armate con questo legante si attivano solo in presenza sia dell'EGFR che del suo ligando EGF, aumentando potenzialmente la specificità del tumore e riducendo la tossicità.
Prospettive cliniche e traslazionali
Traxlmayr ha riconosciuto che l'implementazione di queste tecnologie su larga scala per l'uso clinico richiede un'attenta convalida. Specificità, immunogenicità e sicurezza delle piccole molecole devono essere valutate prima della traduzione. Tuttavia, la modularità dei componenti ingegnerizzati offre un'ampia applicabilità a diversi target e contesti patologici.
"Ci sono molte applicazioni molto interessanti per l'ingegneria proteica nel campo delle cellule CAR T", ha concluso.
Dagli interruttori "on/off" controllati da farmaci ai domini di legame di nuova generazione, il lavoro di Traxlmayr esemplifica come l'ingegneria proteica possa trasformare la terapia con cellule CAR-T da uno strumento potente ma poco efficace in una piattaforma di trattamento altamente modulabile e precisa. Man mano che queste innovazioni si avvicinano alla clinica, potrebbero ridefinire come e quando le cellule T ingegnerizzate vengono utilizzate nel cancro e non solo.
ENGLISH
Michael Traxlmayr shows how protein engineering is creating safer, smarter CAR T cell therapies.
CAR T cell therapy has revolutionized cancer treatment, but its clinical success is tempered by challenges in safety, specificity and control.
Speaking at Technology Networks’ recent “Landscape of Cancer Research: Advances in Immuno-oncology 2025”, Dr. Michael Traxlmayr of BOKU University, Austria, detailed how advanced protein engineering can create “new Lego blocks” for CAR T cells – custom-built molecular tools that improve tumor targeting, reduce toxicity and enable small-molecule control.
“Just imagine you’re playing Lego, and now you can create your own blocks with new properties. That’s what we do for CAR T cells,” Traxlmayr summarized.
From modular design to custom components
Chimeric antigen receptors (CARs) are synthetic proteins assembled from antibody-derived targeting domains, transmembrane regions, and intracellular signaling motifs. Traxlmayr described the field’s evolution from first-generation CARs – effective at killing target cells but lacking persistence – to second-generation designs that incorporate co-stimulatory domains for proliferation and durability.
Protein engineering now enables researchers to go beyond rearranging existing “blocks” to creating entirely new ones. These can be tailored to address limitations in efficacy, specificity and safety.
Switching CAR T cells on and off
One major innovation from Traxlmayr’s group is the development of small-molecule-regulated CAR T “switches.” By splitting a CAR into two separate protein chains – one with the antigen-binding domain, the other with the signaling domain – the T cell remains inactive until a small molecule induces their assembly.
“It’s not like a small-molecule drug you can stop taking. CAR T cells can persist for years. Having a functional control mechanism in vivo would be a major improvement,” he said.
The lab’s retinol binding protein 4-based switch uses a human lipocalin protein that changes conformation upon binding a specific, orally available drug (1120). An engineered binder recognizes only the drug-bound form, enabling precise CAR activation.
Caffeine-responsive cars
Traxlmayr’s team have also built a caffeine-responsive CAR switch. Derived from a camelid nanobody that dimerizes in the presence of caffeine, the system was re-engineered to form heterodimers only when caffeine is present, eliminating background activation.
In vitro, these CARs stayed inactive at caffeine levels typical of people avoiding the compound, but activated at concentrations achievable after a single cup of coffee. In mouse lymphoma models, caffeine administration robustly triggered tumor control.
“We can regulate CAR T cell activity in vivo in mice just via simple administration of caffeine,” Traxlmayr said.
Stabilizing a critical antigen: CD19
CD19 is the most widely targeted antigen in CAR T therapy for B-cell malignancies, yet its extracellular domain is unstable and difficult to produce. Traxlmayr’s lab used directed evolution to identify “superfolder” CD19 variants with just three-point mutations that greatly improve stability while maintaining wild-type binding affinity.
These variants enable:
- Precise affinity measurements for CAR constructs.
- Patient monitoring, using labeled CD19 to detect CAR T cells in blood samples.
- Structural studies, as demonstrated by collaborators who solved the cryo-EM structure of a clinical CAR’s scFv bound to CD19.
MiniCAR platform: Smaller, smarter binding domains
Most CARs use single-chain variable fragments (scFvs) derived from antibodies, but these can mispair, cluster and cause tonic signaling or immunogenicity. Traxlmayr’s team designed the MiniCAR platform – small, single-domain human binding modules selected for stability, expression and low background signaling.
Screening yielded binders to multiple antigens, including CD22, with picomolar affinities. In vitro and mouse models showed MiniCAR-based constructs matched or exceeded the potency of scFv-based CARs.
Targeting tumor-specific receptor conformations
In solid tumors, many “tumor-associated” antigens are also present on healthy tissues, leading to off-target effects. To address this, the lab engineered a binder that recognizes only the active, ligand-bound conformation of EGFR – common in tumor environments due to high ligand secretion.
CAR T cells armed with this binder activated only in the presence of both EGFR and its ligand EGF, potentially increasing tumor specificity and reducing toxicity.
Clinical and translational outlook
Traxlmayr acknowledged that scaling these technologies for clinical use requires careful validation. Specificity, immunogenicity and small-molecule safety all need to be addressed before translation. Yet the modularity of the engineered components offers broad applicability across targets and disease contexts.
“There are lots of very exciting applications for protein engineering in the CAR T cell field,” he concluded.
From drug-controlled “on/off” switches to next-generation binding domains, Traxlmayr’s work exemplifies how protein engineering can transform CAR T therapy from a powerful but blunt instrument into a highly tunable, precise treatment platform. As these innovations progress toward the clinic, they may redefine how and when engineered T cells are used in cancer and beyond.
Da:
https://www.technologynetworks.com/biopharma/articles/protein-engineering-for-next-generation-car-t-cell-therapies-403884
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